多肽固相合成（SPPS）由美国化学家Bruce Merrifield于1963年提出，这一革命性方法使他荣获1984年诺贝尔化学奖。其核心思想是将多肽链的合成固定在不溶性树脂上，通过逐步添加氨基酸单元，最终切割获得目标多肽。这种方法省去了中间产物的分离纯化，极大提高了合成效率。
基本原理与核心优势
SPPS的关键在于固相载体的使用。多肽的C端通过共价键连接到树脂（如聚苯乙烯树脂）上，合成方向从C端向N端逐步延伸。每一步反应后，仅需简单洗涤即可除去过量试剂和副产物，使多步合成得以在单一反应容器中连续进行。这种”过滤-洗涤”的操作模式奠定了自动化合成的基础。
合成流程详解
下图展示了SPPS的完整循环流程：
根据目标多肽C端结构选择树脂：Wang树脂用于获得C端羧酸肽，Rink酰胺树脂用于获得C端酰胺肽。若树脂已预载第一个Fmoc-氨基酸，需用20%哌啶/DMF脱除Fmoc，暴露游离氨基。
2. 氨基酸偶联循环
每个氨基酸的接入包含两个基本步骤：
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活化与偶联：将下一个Fmoc-氨基酸与活化剂（HBTU、HATU等）和碱（DIPEA）混合，生成活性中间体，与树脂上的氨基反应形成肽键
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Fmoc脱保护：用哌啶/DMF脱除新接入氨基酸的Fmoc基团，为下一轮偶联准备氨基
每一步后均需充分洗涤，确保未反应试剂被完全清除。
3. 切割与纯化
合成完成后，用三氟乙酸（TFA）处理，同时实现两个目标：切断多肽与树脂的连接键，并脱除所有侧链保护基。切割液中需加入清除剂（如三异丙基硅烷、水），捕获反应中产生的碳正离子，防止多肽被修饰。粗肽经冷乙醚沉淀、离心收集后，通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，质谱（MS）和HPLC进行表征。
保护基策略
Fmoc/t-Bu法是目前最常用的策略：
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临时保护：α-氨基用Fmoc保护，可在弱碱（哌啶）条件下选择性脱除
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永久保护：侧链功能基用叔丁基（t-Bu）、三苯甲基（Trt）等酸敏感基团保护，最终与TFA切割时一并脱除
该方法条件温和，适合含糖基化、磷酸化等修饰的多肽合成。早期的Boc/Bzl法需用TFA脱Boc、氢氟酸（HF）脱苄基，操作危险性较高，现已较少使用。
优势与局限
SPPS的最大优势在于自动化和高效性——现代合成仪可连续运行数十小时，完成50个氨基酸以内多肽的合成。它还能轻松引入非天然氨基酸、荧光标记等修饰。
然而，该方法也存在局限：树脂和试剂成本较高；合成长链或困难序列（如易形成β-折叠的肽段）时可能出现偶联效率下降、肽链聚集等问题，需通过引入假脯氨酸、使用DMSO等强溶剂或升高温度来优化。
应用领域
从药物研发（如GLP-1受体激动剂、抗菌肽）到抗体片段制备，从功能材料（自组装多肽）到基础研究（蛋白质结构与功能模拟），SPPS已成为生物医药和化学生物学领域不可或缺的工具。
多肽固相合成的问世，将多肽化学从繁琐的液相合成中解放出来，让科学家能够像”搭积木”一样精准构建复杂的肽链。
