分享一篇近期发表在Journal of the American Chemical Society上的文章，题为：End-Group Engineering in Amphiphilic Segmented Polyurethanes: Strong Impact on Hierarchical Self-Assembled Structure and Antibacterial Activity。该文章的通讯作者为来自School of Applied and Interdisciplinary Sciences的Suhrit Ghosh教授。
结构多样的两亲性聚合物在水中会发生自组装，在不同的堆积参数下可能得到胶束、聚合物囊泡或者其它结构。上述体系已经被认为是具有潜在生物应用的候选者。然而，由于生物相容性和生物可降解性上的问题以及缺乏精确的结构，很少有体系能够达到临床实验的标准。
本文中作者开发了一种两亲性的嵌段聚氨酯，其中亲水链段和疏水链段交替排列。在水中，由于分子内氢键的驱动，聚合物会自组装形成具有良好官能团排列的单层聚合物囊泡。鉴于该体系官能团排列良好，同时具有生物相容的聚氨酯骨架，作者设想其可能会有潜在的生物应用。在前期的研究工作中作者合成了一种两亲嵌段聚氨酯P1，发现其自组装形成的聚合物囊泡对Gram-negative E. coli具有良好的抗菌活性（最小抑菌浓度MIC值为7.8 ug/mL）。而在后续探索分子量对抗菌活性的影响时，作者意外发现分子量对抗菌活性影响不大，而聚合物端基结构对抗菌活性的影响很大，因此作者合成了一系列骨架相同但端基疏水性不同的两亲聚氨酯。为保证各聚合物的端基为烃基不同的伯醇，作者在合成聚氨酯时让六亚甲基异氰酸酯（BB）、Boc保护的丝氨醇衍生物（AA）以及伯醇（A）的投料比满足2NBB = 2NAA + NA, 所有的聚合物均用1HNMR和SEC进行表征，见图1的合成路线：（P1a-Boc及后续路线是研究分子量对抗菌活性影响时所做）
图1. 本篇文章中所研究聚合物的结构以及合成路线
首先，作者研究聚氨酯对Gram-negative E. coli以及Gram-positive S. aureus两种细菌的抗菌活性，使用肉汤稀释实验测得的各聚氨酯对两种细菌的MIC值见图2（a）。可以注意到从P1到P5，随着伯醇中烃链的延长，。即聚合物端基疏水性增加，聚合物对两种细菌的MIC值在逐渐变小，抗菌活性在提升。而进一步增长用于封端的伯醇的烃链，从P5到P6会发现MIC值反而增大，表明端基疏水性过大会降低抗菌活性，而端基含有相对亲水的吡啶基团的P7，其MIC值表现出了相当高的MIC值，证实了端基疏水性对抗菌活性的重要性。
图2.（a）聚氨酯对两种细菌的MIC值（2）聚氨酯的HC50值
作者还检验了聚氨酯对杀死细菌和哺乳动物细胞的选择性，对哺乳细胞的杀伤力用裂解50%红细胞所需要的聚合物浓度HC50值来表示，见图2（b）。比较（a）（b）,对P1-P5,HC50的值均显著高于对Gram-negative E. coli的MIC值，表明了很好的选择性，而从P5到P6，HC50 / MIC值显著增大，表明过高的端基疏水性反而对选择性杀伤细胞有负面效应，而P7的HC50 / MIC值约为1.0，说明没有选择性。
然后，作者用多种测试方法对聚氨酯在中等酸性水溶液（PH~5）中的自组装进行了研究。在DLS研究中，新鲜制备的P2-P7均展现了尖锐的单峰，测得的平均流体动力学半径Dh在120-150 nm,而在放置了三天后，再次进行DLS测试，仅P6展现了陈化效应，Dh从150 nm位移到了500 nm。在SANS测试中，除P6以及放置一段时间的P6展现了球形胶束的形态外，其它聚氨酯均展现单层囊泡的形态。
接下来，作者结合上述研究进行分析，描绘了一个自组装模型（见图3）：对于P1-P7，单条聚氨酯链通过主链上氨基甲酸酯键相互形成分子内氢键，得到褶皱结构，形成褶皱结构的聚氨酯链又通过分子间的氢键相互连接得到聚合物囊泡的膜。
图3. 分层自组装过程
在这个过程中，聚氨酯链端的疏水基团只能随着分层组装过程最终分布在聚合物囊泡的内表面和外表面，这与通常两亲分子在水中自组装时会将疏水部分放在远离水的内部的情况不同。由于柔性碳氢链可以落回到聚合物囊泡的疏水表面，以最大限度地减少与水的接触，这种组装方式也是有可能的。当聚合物囊泡通过静电相互作用靠近细胞时，这些疏水的碳氢链可以很容易地参与细胞膜的破坏，这就是聚氨酯链末端结构的疏水性对抗菌活性影响很大的原因。上述猜想可以由之前的实验结果证实：链端含有亲水的吡啶基团的P7抗菌活性远低于P1-P5。对于P6，由于链端的碳氢链过长，聚合物囊泡内部的空腔无法容纳，所以只能形成胶束结构，过长的碳氢链也会屏蔽胶束表面的正电荷，使之难以通过静电相互作用靠近细菌，导致其相比P5抗菌活性降低。此外，P6中碳氢链之间的范德华相互作用可能会使形成的近球形聚合物囊泡相互融合，导致细长结构的缓慢形成。
在理解了聚氨酯链端结构的疏水性对抗菌活性和自组装形态的影响后，作者对抗菌活性最强的P5进行了深入研究。首先，作者用钙黄绿素染料的包覆实验证实了MIC浓度下P5的聚合物囊泡结构的存在：使用染料处理后的P5的紫外-可见光谱在400 – 525 nm的窗口有显著的吸收带，且吸收强度相比水中自由状态下的染料有明显的降低，说明染料位于聚合物囊泡内部的空腔中。DLS测试也表明在MIC浓度或更高浓度（100 ug/mL）下形成的聚合物囊泡有相同的尺寸。
然后，作者研究P5杀死细菌的效力，作者使用不同浓度的P5处理细菌，并测定了不同时间间隔下细菌培养基600 nm 处的光密度 (OD600)来研究细菌的生长，见图4，可以发现在MIC浓度下，两种细菌的生长完全停止，证实了P5在阻止细菌生长上的有效性。
图4.（a）两种细菌在不同浓度的P5处理下的生长曲线（b）数据的3D展示
接下来，作者研究P5抗菌的机制，作者测试了在不同浓度P5处理下带负电的E. coli细菌的zeta电势，发现随着聚氨酯浓度升高，电势逐渐正移（从-15.7到31mV）表明聚氨酯和细菌之间有静电结合。为了检测细菌细胞膜是否发生了破损，作者进行了邻硝基苯基-β-半乳糖苷 (ONPG) 测定，ONPG可以被细菌细胞内的β半乳糖苷酶分解产生黄色的硝基苯酚.在测定中，加入P5后，体系在420nm处产生了尖锐的吸收峰，表明细菌细胞膜发生了破损，而在控制实验中，没有发现相应吸收峰。为了检测在P5处理后两种细菌的形态改变，作者拍摄了两种细菌的FE-SEM图像，见图5，可以发现用P5处理3h后，两种细菌的形态和细胞膜都被彻底破坏。上述实验结果说明P5通过破坏细菌的细胞膜杀死细菌。这种通过破坏细菌的细胞膜来杀死细菌的思路，目前在全球卫生治理中被用于耐药性细菌的治理，作者也开展了P5抗击耐药性细菌的实验，并取得了很好的抗菌效果。
图5. E. coli的FE-SEM图像在P5（a）处理前（b）处理后，S. aureus的FE-SEM图像在P5（c）处理前（d）处理后
综上所述，本文开发了一种可以在水中分层自组装的新型两亲性聚氨酯。通过提高聚氨酯链端结构的疏水性，聚氨酯的抗菌活性可以显著提高。聚氨酯的抗菌机理为：聚氨酯形成聚合物囊泡后部分疏水末端分布于囊泡外表面，在与细菌接触时可以破坏细菌的细胞膜。这项工作为通过精确的“端基工程”设计高性能抗菌聚合物以解决耐药菌问题提供了新范式，具有重大应用前景。
作者：LH
DOI: 10.1021/jacs.5c06603
Link: https://doi.org/10.1021/jacs.5c06603
