介绍一篇发表在JACS上的文章“A Post-translational Histidine−Histidine Cross-Link Enhances Enzymatic Oxygen Reduction Activity with Greater pH Adaptability”，通讯作者是来自德克萨斯大学奥斯汀分校的Yi Lu教授，来自美国太平洋西北国家实验室的John Cort教授和Joshua Adkins教授，其中，Yi Lu的主要研究兴趣是生物催化和合成生物学，John Cort的研究兴趣是结构生物学，Joshua Adkins的研究兴趣是综合组学和系统生物学。

该研究聚焦于蛋白质翻译后修饰（PTM）中的一种新型组氨酸-组氨酸（His-His）交联结构的发现与功能分析，探索其在氧化酶模型F33Y-CuBMb（基于抹香鲸肌红蛋白改造）中的形成机制、结构特征及其对氧还原反应活性的调控作用。

蛋白质残基之间的交联是翻译后修饰（PTM）的一种，其在调节蛋白质的功能特性中起着关键作用，除最常见的二硫键外，一个典型的例子是Cys-Tyr交联，在铜酶半乳糖氧化酶中调节还原电位，并保持活性位点的结构稳定性。但对于这些交联的研究还存在很多局限，一是仅在有限数量的酶中发现少量交联个例，二是它们对氧化还原活性的确切作用尚未完全了解。在本文研究中，作者从血红素-铜氧化酶入手，使用其简化的工程化模型F33Y-CuBMb尝试其活性中心的His-Tyr交联，并发现利用过氧化氢诱导可促使该蛋白中形成一种此前未被报道过的His-His交联。

通过MALDI-TOF MS和LC-MS/MS鉴定交联产物，作者确认交联位点为His29与His4，核磁共振结果证实了交联位点，并进一步确认交联连接为Nε2(His29)-Cδ2(His43)。作者还在X射线晶体衍射结果中观察到Tyr33与His43之间的Tyr-O-His交联，作者推测该结构为His-His交联形成的前体。

随后，作者通过停流紫外-可见光谱（Stopped-flow UV-vis）检测到Fe(IV)=O中间体，并利用电子顺磁共振（EPR）观察到酪氨酸自由基信号，证实其参与交联形成。基于上述结果，作者描绘出了该His-His交联的形成机理：过氧化氢提供III价和IV价铁循环的氧化还原动力，Fe(IV)=O 夺取 Tyr33 酚电子，形成酪氨酸自由基并攻击 His43 形成 Tyr-O-His交联，由于残基柔性，重排为热力学更稳定的 N-C 型 His-His 交联（能量约低 15 kcal mol⁻¹）。作者还构建了Tyr33 突变体（F33P）发现不会再生成 His-His 交联，验证 Tyr 为必需的“催化碱”。

最后，作者通过对交联前后酶活的检测，确认了该交联对酶活具有显著的提升效果。未交联蛋白最适pH为6.0，pH ≥ 8.0时即失活；交联后蛋白则可保持活性峰值保持到pH 9.5，且pH 7.0时催化速率相比于交联前提高2.9倍。通过突变扫描方法，作者发现蛋白的酶活H43E > H43F > H43Q≈未交联，而交联后活性与H43E相当，且His43预测pKa在交联后降至4.6（接近 Glu）。该结果说明交联通过“酸化”His43，增强其质子转移/氢键受体能力，从而优化氧还原路径。

总的来说，本研究不仅首次结构明确地揭示了一种新型的His-His交联结构，还阐明了其通过氧化自加工机制形成的路径，并证明该交联可显著增强人工氧化酶的催化活性与pH适应性。这一发现为理解天然氧化还原酶中交联结构的形成与功能提供了新视角，也为设计具有更高活性和稳定性的人工金属酶提供了新策略。

本文作者：FTY

责任编辑：MB

DOI：10.1021/jacs.5c12710

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c12710