分享一篇发表在Anal. Chem.上的文章，题目为“Multiplexed Data-Independent Acquisition-Based Proteomics Enabled by TMTpro Complementary Ions”，通讯作者是来自威斯康星大学麦迪逊分校的李灵军教授，她的研究方向聚焦于开发定量质谱策略用于神经肽等研究。这篇文章中，作者提出了一种基于TMTpro互补离子的新型DIA策略。

数据非依赖性采集（DIA）是目前蛋白质组学领域的重要方法，然而无标记的DIA定量仍可能在样品制备、进样和色谱保留时间比对过程中产生误差。采用TMT等同量异位标签的多重蛋白质组学可以提高分析的通量和重复性，但在DIA模式较大的隔离窗口下，报告离子会受到共碎裂肽段的干扰，影响定量比值准确性。因此作者提出一种基于TMTpro互补离子（TMTproC）的DIA分析策略。

这一策略的核心是TMTpro试剂在HCD断裂中产生报告离子，并留下一个互补离子，即连接有平衡基团的完整肽段。作者选择了126、131N和135N三个TMTpro通道，每个通道产生的互补离子存在4 Da的间距，最大程度避免了同位素重叠。

为了验证该方法，作者选择了两种质量相近的标准肽段，分别以1:5:10和10:5:1的比例在同一DIA隔离窗口中进行混合分析。在二级谱结果中，低质量区的报告离子比值接近1:1:1，而高质量区的互补离子则准确还原了预期的标记比值，证明TMTproC-DIA策略有助于避免定量干扰。

接着，作者优化HCD碎裂能量，观察到NCE为29%时标准肽段可以产生最多的互补离子，以及在蛋白质组中获得最多的蛋白质定量数。

基于优化的HCD条件，作者进一步测试了TMTproC-DIA流程的定量准确性。作者将三重TMTpro标记的BSA肽段以1:1:1、10:5:1和1:5:10混合分析，结果显示互补离子定量比值与理论比值高度一致。

最后，作者将来自HeLa和酵母的蛋白质组分别以1:1:1和1:5:10进行标记后，将两种蛋白质组以1:3的比例混合分析。在这一体系中，HeLa蛋白和酵母蛋白的定量比值都非常接近其理论比值，证明了TMTproC-DIA策略的定量准确性和鲁棒性。

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总的来说，本篇文章中作者提出基于TMTpro互补离子的DIA策略，将同量异位标签与DIA模式结合实现更稳健的定量蛋白质组学分析。

本文作者：LCX

责任编辑：LZ

DOI：10.1021/acs.analchem.5c03563

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c03563