分享一篇发表在Angewandte Chemie上的文章，题目为“Targeting the Spliceosomal Protein USP39 Through Allosteric Ligands and PROTAC-Induced Degradation”。通讯作者是来自德国法兰克福大学布赫曼分子生命科学研究所Dr. Xinlai Cheng。主要研究方向基于细胞的高通量筛选和药物再利用。

RNA剪接是调控真核生物基因表达的关键过程，通过选择性剪接，单个基因可产生多个蛋白质亚型。剪接失调与多种疾病密切相关，特别是癌症和神经退行性疾病。作为剪接体的核心组分，USP39（泛素特异性蛋白酶39）在维持剪接体完整性和功能中扮演关键角色，但其缺乏催化活性，属于典型的“无口袋、无酶活”蛋白，传统小分子药物开发面临巨大挑战。

该课题组综合运用热迁移实验（基于约200个小分子内部库）与DNA编码化合物库筛选，通过检测USP39热稳定性变化及DNA条形码富集分析，从多类化学结构中鉴定出两个先导噻唑类配体：USP39_B1与USP39_B2。实验验证表明，两者均直接结合USP39蛋白（热迁移ΔTm = -2.5°C），其中USP39_B1对全长蛋白的亲和力KD = 3 μM，并特异性靶向其锌指结构域。

后续作者运用AlphaFold3准确预测了USP39_B1在锌指结构域表面的结合模式，其相互作用包括与Tyr142和Gly140的氢键、与Tyr142苯环的π-π堆积以及由Phe120/Leu123/Leu128形成的疏水口袋。通过精细设计的点突变实验，证实上述关键残基（实验组ZNF_M1）对结合不可或缺，而邻近无关残基（对照组ZNF_M2）则无影响，从计算到实验完整揭示了配体-靶点的分子识别机制。基于已阐明的结合模式，作者对噻唑母核的苯环进行了系统性修饰。研究发现：苯环间位是关键的活性优化位点，引入氟原子（USP39_B3）可显著提升结合活性（IC50从~3 μM优化至1.18 μM）；而邻位取代则因空间位阻完全破坏了结合。这一结果清晰地揭示了配体与锌指结构域结合口袋的空间兼容性规则，为后续理性设计提供了明确指导。

作者基于优化的USP39配体，成功设计并合成了靶向降解分子 USP39_PROTAC_V1。该分子采用VHL E3连接酶配体与PEG3连接子，展现出良好的理化性质（MW 870.5，LogP 4.50）与强效的体外结合能力（三元复合物KD = 232 nM）。在细胞层面，USP39_PROTAC_V1实现了高效、特异且机制明确的靶蛋白降解。

为验证USP39降解的生物学功能，作者检测了已知受USP39调控的特定剪接事件。结果表明，经 USP39_PROTAC_V1（10 nM，24小时）处理的细胞，成功复现了遗传学上敲低USP39导致的剪接模式改变：在 ZNF414 基因中观察到外显子1延长，而在 CRK 基因中则出现外显子1缩短。这些变化均源于非典型5’剪接位点使用的增加。

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总之，本研究成功开发出靶向“不可成药”剪接体蛋白USP39的PROTAC降解剂，在纳摩尔浓度下实现高效特异性降解，并精准复现了USP39缺失导致的剪接调控缺陷，为相关疾病治疗提供了新策略。

本文作者：CZH

责任编辑：LYC

DOI：10.1002/anie.202516809

原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202516809