分享一篇发表在Cell Chem. Biol.上的文章，文章题目为“Targeted inhibition of mu-opioid receptors in neuronal subpopulations by membrane-tethered Naloxo-DART antagonists”，本文通讯作者有四位，分别为来自诺丁汉大学的J. R. Lane助理教授，来自哥伦比亚大学的J.A. Javitch教授，来自巴斯大学的C.P. Bailey老师，以及来自NIH的A.H. Newman。
μ-阿片受体（MOR）几乎在所有与疼痛相关的神经细胞中表达，由于这种广泛表达，将特定细胞中阿片受体的活性与行为或生理过程联系起来较为困难。使用遗传学工具敲除特定细胞中的靶蛋白，可以实现细胞特异性，但是这种敲除是永久性的，可能会引起代偿变化，而光遗传或化学遗传学方法，比如DREADD（designer receptor exclusively activated by designer drug）要在细胞中表达经人工修饰的靶蛋白，可能与内源表达的蛋白仍有一定区别。
于是本文研究者想到了膜锚定急性限制药物策略（drugs acutely restricted by membrane tethering，DART），该方法由两个组分组成，一个是Halo标签与膜锚定结构域融合表达的蛋白（Halo-Mem），这个蛋白只会在特定的细胞亚群中表达，一个是小分子配体部分。小分子配体含有三个组成成分，一个是会与靶蛋白结合的配体，一个是会与Halo标签共价反应的基团，二者通过linker连接。那么在Halo-Mem存在的情况下，其附近的配体浓度会显著提高，实现对靶蛋白的抑制。
为了针对MOR得到DART平台，作者将MOR的经典拮抗剂纳洛酮与Halo反应基团通过不同长度的PEG链连接，得到NLX-DART12、NLX-DART24、NLX-DART36三种DART分子，通过与放射性标记的激动剂[3H]-DAMGO竞争，作者检测了三种分子对MOR的亲和力，目标是筛选得到一个中等亲和力的配体，这样只有在Halo-Mem存在的情况下，该分子才会与MOR相互作用，发挥抑制能力。检测结果表明NLX-DART24具有中等亲和力。
之后作者基于血小板衍生生长因子受体（PGDFR）跨膜结构域或者GPI锚设计了不同的Halo-Mem构造体，分别记为Halo-TM和Halo-GPI。将不同构造的Halo-Mem构造体与MOR共表达，然后在纳洛酮、NLX-DART12、NLX-DART24、NLX-DART36浓度递增的情况下，检测下游信号的变化，发现NLX-DART24与Halo-LK3-TM的组合可以实现最理想的效果，之后作者优化了NLX-DART24的工作浓度、时间，且NLX-DART24在MOR\KOR\DOR中表现出了较好的选择性。
之后，作者将该系统应用在小鼠脑片及活体小鼠中，以验证该系统在真实应用场景中的可行性。作者利用TH-Cre小鼠模型，结合Cre依赖的腺相关病毒（AAV），在蓝斑核（LC）的特定神经元中特异性表达Halo-LK3-TM。之后，对小鼠脑片孵育或者在活体小鼠中注射NLX-DART24，采用全细胞膜片钳技术检测下游GIRK电流变化。实验发现，无论是在体外给药还是在体内给药24小时后，NLX-DART24均只在预先表达了Halo-LK3-TM的神经元中展现出强大且持久的拮抗效应，说明该方法在活体动物中有较好的细胞特异性和应用潜力。
综上所述，作者基于DART技术原理，为研究不同神经元亚群中μ-阿片受体的功能设计了Naloxo-DART平台。
本文作者：LZ
责任编辑：WYQ
DOI：10.1016/j.chembiol.2025.11.002
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2025.11.002
