分享一篇发表在 Chemical Science 上的文章，题目为“Internally quenched fluorescent peptides provide insights into underexplored and reversible post-translational modifications”。通讯作者为宾夕法尼亚大学的George M. Burslem教授，其课题组长期致力于利用化学手段研究翻译后修饰（PTMs）及其在表观遗传调控中的功能。

翻译后修饰（如乙酰化、甲基化、乳酸化等）通过动态的“写入”和“擦除”过程精密调控着蛋白质的功能，然而，目前对这些过程的定量研究仍面临巨大挑战。质谱技术虽然能提供详尽信息，但通量低且昂贵；而广泛使用的抗体检测则常因修饰间的结构相似性（如乙酰化与乳酸化）而遭受交叉反应的困扰。因此，开发一种能够特异性、高通量且实时监测特定位点PTM酶活性的化学工具显得尤为迫切 。

由此出发，作者受到蛋白酶底物研究中常用的内部猝灭荧光（IQF）策略的启发，构建了一套巧妙的“蛋白酶门控”检测系统。该系统的核心原理在于利用胰蛋白酶对赖氨酸和精氨酸残基的严格切割特异性：当这些位点处于裸露状态时，胰蛋白酶能切断肽链，使原本因距离相近而被猝灭的荧光基团（Abz）与猝灭基团（Dnp）分离，从而产生强烈的荧光信号；而一旦这些位点发生了酰化、甲基化或瓜氨酸化等修饰，胰蛋白酶的切割活性便会被阻断或显著抑制。基于此，若在体系中加入“写入器（writer）”，产生的修饰将保护肽链免受切割；反之，若加入“擦除器（eraser）”，修饰基团的脱落将重启胰蛋白酶的切割，导致荧光“开启”。

为了克服许多修饰氨基酸（如乳酸化、β-羟基丁酰化）合成困难的瓶颈，作者还引入了硫赖氨酸（thialysine）和硫精氨酸（thiaarginine）模拟物，通过半胱氨酸的高效偶联化学，快速构建了涵盖多种复杂PTM的底物库 。在第一个应用例中，作者利用该平台对一系列表观遗传酶进行了深入的底物谱学分析，揭示了SIRT3和HDAC2在底物选择性上的细微差异。作者发现，SIRT3能有效去除组蛋白H3K9位点的乙酰化和乳酸化修饰，但对β-羟基丁酰化修饰则不能，且在H3K14位点上活性极低；相比之下，HDAC2虽然也偏好H3K9位点，但却具有可逆的酰化酶活性：在高浓度乳酸或β-羟基丁酸存在下，HDAC2能够充当“写入器”，催化安装乳酸化甚至β-羟基丁酰化修饰。这一发现挑战了传统上将HDACs仅视为“擦除器”的认知，暗示了其在特定代谢环境下的双向调控潜力 。

随后，作者进一步展示了该策略的广泛适用性，不仅验证了HDAC6对微管蛋白K40位点的去乙酰化及潜在的乳酸化活性，还成功应用于去甲基化酶（KDM3A/4A）和精氨酸脱亚氨酶（PAD4）的研究。有趣的是，作者发现PAD4无法耐受硫精氨酸模拟物，这提示该拟态可能作为一种能抵抗瓜氨酸化的功能性探针。此外，该系统还被用于探究相邻位点修饰间的“串扰”效应，例如H3S10的磷酸化被证明会显著调节酶对邻近H3K9位点修饰的去除速率。

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总结而言，作者开发了一种基于蛋白酶敏感性的荧光“开关”策略，为解析复杂的表观遗传修饰图谱及酶学机制提供了一种便捷的化学生物学工具 。

本文作者：TYC

责任编辑：WYQ

DOI：10.1039/D5SC08759G

原文链接：https://doi.org/10.1039/D5SC08759G