分享一篇发表在JACS上的文章，题目为“Peptidyl Asparaginyl Ligase-Mediated Orthogonal Ligation at Non-Asx Peptide Bonds for D-Peptide Cyclization and Antibody Dual Labeling”。通讯作者是南洋理工大学的刘传法教授，课题组专注于酶催化蛋白质修饰与化学生物学工具开发。
肽基天冬酰胺连接酶（PALs）是一类高效且特异性强的酶工具，能够催化蛋白质的转肽反应，广泛应用于蛋白质N端或C端标记。然而，传统PALs介导的连接反应存在两大局限：一是严格依赖P1位点的天冬酰胺（Asn）或天冬氨酸（Asp）残基（统称Asx），限制了底物范围；二是反应可逆性导致连接效率降低。尽管已有研究通过添加淬灭剂或利用侧链修饰部分克服可逆性问题，但Asx依赖性始终未解决。为此，本研究提出了一种创新策略：利用肽基-硫代乙酰胺作为酰基供体底物，实现PALs催化的非Asx肽键不可逆连接，从而突破上述瓶颈。
研究团队首先通过模型肽实验验证新策略的可行性。设计线性肽H₂N-GVYSAYGPRALG-SCH₂CONH₂作为底物，在VyPAL2催化下（酶底物比0.005当量），1小时内即可实现近定量环化（转化率>95%）。对比传统Asx依赖的底物（Ac-GVYSAYGPRALGN-GL），硫代乙酰胺底物虽初始反应速率稍慢，但因反应不可逆，最终产率显著提升（95% vs. 59%）。进一步筛选发现，C端甘氨酸（Gly）为最优残基，而倒数第二位点可兼容多种氨基酸，凸显PALs的底物灵活性。酶动力学分析表明，OaAEP1b-C247A和VyPAL2在pH 7时催化效率分别为7.58×10⁴ M⁻¹ s⁻¹和2.59×10⁵ M⁻¹ s⁻¹，虽低于典型Asx底物，但不可逆特性与产物稳定性（新生成的非Asx肽键不被PALs识别）弥补了效率差异。
研究人员将该策略成功拓展至D-肽环化领域。VyPAL2能够以0.01当量催化全D-氨基酸肽（H₂N-GvysayGpralG-SCH₂CONH₂）的环化反应，5小时内产率接近定量，而相同条件下sortase A仅产生< 10%环化产物且以水解副反应为主。团队进一步合成了D-型卡诺环素A（Ccl），一种60氨基酸的环状细菌素。通过微波辅助固相肽合成线性前体，经硫代乙酰胺化后，VyPAL2催化环化产率达94%。圆二色谱证实合成D-Ccl与天然L-Ccl构象镜像对称，且两者对金黄色葡萄球菌均表现出强效抗菌活性（MIC值相当），而线性前体无活性。这是首次实现PALs介导的D-肽环化，极大拓展了酶工具的应用边界。
在蛋白质标记方面，研究团队针对抗EGFR affibody（ZEGFR）和抗HER2 DARPin模型蛋白，实现了N端特异性修饰。将荧光染料（FAM）、细胞毒性药物（MMAE）、金属螯合剂或生物素等功能基团通过硫代乙酰胺底物连接至蛋白N端，VyPAL2催化下（酶底物比0.005当量），产率均优于90%。关键的是，非Asx连接产物在人源legumain（一种AEP蛋白酶）中孵育48小时仍保持稳定，而传统Asn连接产物水解率达50%，这证明了新策略可增强体内稳定性。功能实验显示，FAM标记的DARPin能特异性结合HER2高表达BT474细胞，MMAE-DARPin对BT474细胞IC₅₀为12.8 nM，而对低表达HER2的MCF-7细胞无毒性，凸显其靶向治疗潜力。
基于非Asx连接的正交性，团队开发了序列连接方案制备双payload抗体药物偶联物（ADCs）。以曲妥珠单抗为模型，其轻链N端引入GI二肽作为VyPAL2底物，重链C端引入DQL三肽作为OaAEP1b-C247A底物。第一步，VyPAL2催化MMAE连接至轻链N端，产率95%，所得单payload ADC（2）对BT474细胞IC₅₀为0.612 nM，选择性指数超100倍。第二步，OaAEP1b-C247A在pH 7下催化DXd连接至重链C端，联合谷氨酰胺环化酶（QC）淬灭副产物，双payload ADC（3）产率92%，活性进一步提升（IC₅₀=0.233 nM）。同样策略制备的MMAE/MMAF双payload ADC（4）对BT474细胞IC₅₀达0.129 nM。该方案首次实现PALs介导的抗体双位点正交标记，为均质双payload ADC开发提供了新思路。
总之，本研究通过设计肽基-硫代乙酰胺底物，突破了PALs的Asx依赖性和可逆性限制，实现了高效不可逆的非Asx肽键连接。其应用涵盖D-肽环化、蛋白质N端标记及抗体双重偶联，显著提升了PALs的工具价值。该策略为多功能蛋白质 therapeutics（尤其是ADC药物）的开发开辟了新途径，有望推动精准医疗领域的创新。
本文作者：TZS
责任编辑：WYQ
DOI：10.1021/jacs.5c20426
原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c20426
