分享一篇发表在JACS上的文章。文章的题目是“基于噻蒽鎓化学的细胞内蛋白–蛋白相互作用识别方法”。文章的通讯作者是来马克斯–普朗克煤炭研究所的Tobias Ritter教授。该团队主要研究方向包括芳烃后期官能团化、光催化及新型试剂开发等。
蛋白质–蛋白质相互作用（PPIs）调控着细胞内的关键生命过程，包括信号转导与代谢调控等。在原生细胞中检测蛋白互作的多种方法中，化学交联因能将弱或瞬时相互作用固定为共价键而尤为重要。传统双功能亲电交联剂多靶向赖氨酸，但其通常需要较长连接臂或大体积结构，降低细胞通透性并易导致假阳性。光自由基交联可提供短距离约束，但依赖紫外光、步骤繁琐，且难以对低丰度产物进行富集。当前仍缺乏既能在天然残基上形成短寿命中间体、又能单步完成短距离交联并兼容亲和富集的策略。
作者前期的研究表明，乙烯基噻蒽鎓（VTT）可通过 Cys 的极性反转实现快速体外蛋白交联，其关键在于 Cys 对 VTT 加成的速率决定步骤，氨基酸进而释放噻蒽离去基并生成高度亲电中间体episulfonium，该中间体可被邻近亲核体迅速捕获，形成稳定且位于蛋白表面的交联。与传统双功能亲电交联剂不同，VTT 交联为单步过程，也无需紫外光激活。但 VTT 产物仅通过简单乙烯键连接，无法用于后续的富集操作。
基于此，作者提出开发一种可在分子内置换后形成取代 episulfonium 的新型试剂，作者利用含短连接子的烯烃标签合成了新型噻蒽鎓交联剂 TTD，其 logP 和 TPSA 与 VTT 相近，因而保持良好细胞通透性。TTD 在缓冲液中可快速去质子化生成高反应性的烯基噻蒽鎓中间体，与半胱氨酸发生 Michael 加成并形成 episulfonium 交联中间体。该试剂无需紫外激活，可直接与含 Cys 的蛋白质定点交联，产物分布与 VTT 一致，并且不与不含 Cys 的蛋白反应，证明其可用于后续富集的 Cys 选择性交联应用。将 TTD 处理 HEK 细胞后，烯烃标签成功掺入细胞蛋白，并经 CuAAC-荧光检测显示具有良好细胞通透性和高效标记。进一步结合 CuAAC-生物素化、胰酶消化及亲和富集，LC–MS/MS 分析表明半胱氨酸位点选择性达 86%，仅约 7% 未修饰肽被富集，说明标记与富集均具有高特异性。在严格 1% FDR 控制下，共鉴定到 1534 个蛋白内和 100 个蛋白间交联，覆盖细胞全部主要区室。交联涉及多类亲核残基，体现 TTD 生成的 episulfonium 中间体的高反应性，有助于捕获短距 PPI。
在 20 个由 ≥3 条交联支持的 PPI 中，15 个已在 STRING 中得到注释，且全部 STRING 评分均高于 0.5，仅 2 个低于 0.9，证明交联结果高度可信。以 TCP-1 环复合体为基准，所有 TTD 交联残基间距均 ≤17 Å，与理论范围一致，说明烯烃标签不影响距离约束。基于 TTD 的短距（≤23 Å）交联可准确建模 PPI，预测结构与实验证据高度一致。
基于 TTD 提供的短距约束，作者成功建模了缺乏结构信息的 VDAC2–VDAC3 相互作用。利用赖氨酸选择性交联剂 DSSO（最长约束达 35 Å）进行对接则给出不合理的正交结构，说明长且柔性的距离限制会误导建模。结果表明，TTD 的短距、高精度交联更适合用于可靠的 PPI 结构预测。除VDAC外，作者还发现 RACK1 与 Vigilin 之间的 7 个交联。该相互作用对登革热病毒复制至关重要，具潜在治疗价值。基于 TTD 的交联约束进行对接，作者获得了 Vigilin 的 KH-14 与 RACK1 WD-1/WD-2 结合的模型。本研究首次在哺乳动物细胞中提供其化学交联证据并预测了相互作用界面。
作者利用 TTD 交联在细胞中识别到多种此前未被报道的 PPI，包括 RACK1–CDV3 及与肿瘤相关的 MDH2、PHGDH、EPHX1、PARK7 的相互作用。GO 注释显示这些蛋白多位于同一或相邻区室。PHGDH–CEP112 的交联在两次重复中检测到，提示形成稳定复合物，并可能将 PHGDH 依赖的丝氨酸代谢与中心体相关翻译调控连接。基于交联距离限制的对接模型显示 PHGDH 与 CEP112 N 端结合，界面以静电作用为主。结果表明，TTD 交联结合富集策略可发现新型 PPI 并辅助预测其相互作用表面，为后续功能研究提供起点。
总之，作者开发了一种具有生物正交手柄的单步交联试剂，可原位生成高反应性的 episulfonium 中间体，实现蛋白组范围内的 Cys 选择性标记、富集与 PPI 捕获。其快速形成的短距离交联能高效记录近程相互作用，并支持高可信度的界面建模，优于传统长连接子双功能试剂。由于低丰度 Cys 可自然引入蛋白质中，该方法为细胞内相互作用组研究提供了高效的一步式策略。
本文作者：THT
责任编辑：LYC
DOI：10.1021/jacs.5c16665
原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c16665
