分享一篇发表在J. Am. Chem. Soc.上的文章，文章题目为“Evolution of Cross-Linking Aptamers for Long-Lasting Membrane Protein Labeling”，本文通讯作者为来自北京大学药学院的张力勤研究员和王晶教授，前者课题组主要关注于新型核酸药物、探针和检测方法、药物新靶点发现、功能基因组学等领域的研究；后者专注于开发信号转导小分子的分子探针以及通过蛋白组学，高通量测序等技术研究其调控机制等研究。

细胞膜蛋白介导通信、信号传导和运输，是药物开发中一类重要的靶标。然而，受限于膜蛋白的疏水性与动态构象，目前开发的非共价探针无法捕捉瞬时或低丰度的状态，在复杂样品中的分析信号可靠性不足，因此需要开发新型的共价探针。适配体具有灵活的结构和较高的筛选效率，成为膜蛋白研究的新型工具。共价交联的适配体具有高稳定性、高灵敏度和背景信号低等优势，目前开发共价适配体多基于重组蛋白和凝胶筛选的工作流程，难以反映膜蛋白在细胞环境下的构象状态。本文作者利用SuFEx反应，开发了一种新型体外进化策略，进行重组蛋白水平和细胞水平的共价适配体筛选，从而得到对目标蛋白表现出持续且特异性结合的共价适配体。

考虑到SuFEx反应的反应性和选择性，作者首先利用EdU向文库中引入了芳基磺酰氟反应基团，得到初始文库之后，作者先进行了两轮预筛选，将随机文库与固载有重组蛋白的磁珠孵育，用7 M尿素的严苛洗脱条件得到能与重组蛋白反应的适配体文库，进入基于蛋白的筛选过程。在基于蛋白的筛选中，作者利用乳液PCR制备单克隆展示磁珠，将展示磁珠文库与带有His tag的重组蛋白孵育，通过95℃加热或者用7 M尿素洗涤，除去非共价结合的磁珠，再加入荧光染料标记目标蛋白，通过流式细胞术分选出荧光信号最强的磁珠，认为这些磁珠上的适配体具有较高的亲和力和反应性，经过三轮的基于蛋白的筛选，作者得到富集的适配体文库，进入基于细胞的筛选。在基于细胞的筛选过程中，富集文库与过表达POI的细胞一起孵育，用单链DNA结合蛋白（SSB）除去未与靶蛋白反应的适配体，之后扩增、重新偶联交联剂，经过三轮基于细胞的筛选，最终得到的文库进行测序，识别其序列，得到候选的交联适配体（xl-aptamers）。

作者用PD-L1和EpCAM作为研究模型，筛选了它们的共价交联适配体，各自得到8个候选序列，对这些适配体进行表征，发现它们的稳定性好、特异性较高，不会与无关蛋白发生反应。

作者还对比了共价适配体与非共价适配体在实际应用中的标记稳定性，非共价适配体在孵育4 h后，标记信号消失，导致无法区分不同的细胞群体，而交联适配体仍可以提供稳定的标记和可靠的细胞分选，表明共价适配体的稳定性及其作为单细胞和空间蛋白质组学长效探针的潜力。

​

综上所述，作者构建了一个筛选交联适配体的方法，将重组蛋白层面的筛选与细胞层面的筛选结合起来，得到稳定性更好、亲和力和选择性较好的共价交联适配体，为膜蛋白的长效标记提供了有力工具。

本文作者：LZ

责任编辑：WYQ

DOI：10.1021/jacs.5c16570

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c16570