分享一篇最近发表在JACS上的通讯文章，文章标题为Biocatalytic Stereodivergent Construction of Axially Chiral Tri- and Tetrasubstituted Allenols via Desymmetric Hydroxylation。文章的通讯作者是来自遵义医科大学的陈永正教授。

    轴手性联烯（axially chiral allene）作为基本构筑单元被广泛应用于合成天然产物和药物。然而，目前三、四取代轴手性联烯的构建仍欠探索，并且没有关于三、四取代轴手性联烯醇（allenol）合成的报道。P450单氧化酶因其优异的选择性羟化催化能力而备受化学工作者的青睐，但是目前P450酶只能催化中心手性（centrally chiral）C-H键羟化，而轴手性C-H键羟化未见报道。羟化轴手性C-H键存在多种挑战：（1）催化循环的关键物种Fe(IV)通常不能识别联烯的双键和C-H键，导致低的化学选择性；（2）sp³联烯基自由基与其共振式sp²烯丙基在体系中同时存在，导致低的区域选择性；（3）立体选择性也存在不小挑战。如图1所示，本文中作者首次报道了一种工程化P450pyr酶的创新策略，该酶能够在柔和条件下催化三、四取代轴手性联烯醇的立体发散性合成。

图1. 轴手性联烯的不对称合成。

如图2所示，作者首先采用半理性定点突变（semirational site-directed mutagenesis）方法，结合P450pyr与底物1a的分子对接（molecular docking）模拟，得到了位于酶核心口袋附近的关键残基信息。进一步，他们采用重复饱和突变（iterative saturation mutagenesis，ISM）方法，最终得到了对映选择性表现最优的I82F和I82V/T186F/V254S突变体，前者能得到S构型的产物2a，而后者能得到R构型的产物2a。通过优化和筛选反应条件，作者将底物空间拓宽到多种三、四取代联烯上，两种工程化P450pyr酶均能以高对映选择性得到对应构型的产物。

图2. 工程化P450pyr酶催化合成轴手性联烯醇示意图。

如图3所示，作者将I82V/T186F/V254S突变体应用于放大合成和有机合成转化中。该突变体能够催化得到百毫克数量级的产物(R)-2a，且该化合物能够进一步转化为多种有机化合物，这彰显了工程化P450pyr酶在有机合成转化中的应用潜力。

图3. 工程化P450pyr酶用于放大反应和有机合成。

如图4所示，作者最后利用分子对接模拟探究了工程化P450pyr酶的立体选择性羟化机制。在I82F突变体中，增大的苯丙氨酸侧链使得化合物1a向V254偏移，进而使pro-S–C（C_s）原子更靠近血红素中心，因此得到S构型的产物。而在I82V/T186F/V254S突变体中，V254S突变破坏了底物芳环与缬氨酸的疏水作用，因此使得底物翻转；同时V82和F186残基产生了新的疏水作用，进而稳定底物的结合，并导致pro-R–C（C_R）原子更靠近血红素中心，因此得到R构型的产物。

图4. 分子对接模拟工程化P450pyr酶-底物结合情况。

总的来说，作者开发了两种工程化P450pyr酶，它们能够立体发散地构建轴手性联烯醇，这也是轴手性联烯醇合成的首例。未来，作者将进一步应用他们开发的P450pyr酶生物催化平台来构建多种轴手性分子。

作者：CHR  审校：QJC

DOI: 10.1021/jacs.5c08146

Link: https://doi.org/10.1021/jacs.5c08146