分享一篇最近发表在JACS上的文章，题目为Optimizing Stability in Dynamic Small-Molecule Binding Proteins。文章的通讯作者是来自维茨曼科学研究所（Weizmann Institute of Science）的Sarel J. Fleishman和来自拜罗伊特大学（University of Bayreuth）的Birte Höcker。
动态蛋白可以在多种构象之间发生转变，因此能够产生多种同构调控或共协作功能。动态蛋白的折叠自由能景观（folding landscape）可用来描述不同构象之间的平衡，因此研究自由能景观对动态蛋白的热稳定性研究具有重要意义。然而，动态蛋白的自由能景观相对复杂，难以通过计算直接预测。目前，蛋白质修复一站式软件（protein repair one-stop shop，PROSS）在单一构象蛋白质的耐热性设计中取得了不错的效果，且在一些动态蛋白的设计中也颇有成效，但是目前PROSS对细胞周质结合蛋白（PBP）的耐热性设计并不有效。PBP具有开放和封闭两种构象，结构相对复杂，因此其耐热性设计存在不小挑战。本文中，作者在PROSS软件的基础上采用双状态分析（two-state analysis）策略，即同时考虑突变对两种构象自由能的影响，成功设计了更耐热且保持原有活性的PBP突变体，这为动态蛋白的耐热性设计提供了新的研究思路。
如图1所示，作者选择了四种PBP（PotF、TphC、MBP和LAO）作为初始输入设计集X.0。随后，作者利用PROSS软件进行了单状态设计（one-state design），即只考虑PBP的某一构象，分别生成了开放和封闭两种构象的设计集X.1、X.2。进一步，作者对这些设计集进行双状态分析，剔除不稳定突变后得到了设计集X.3。最后，作者增加了突变区域约束条件，得到了设计集X.4。
图1. PBP耐热性设计策略示意图。
如图2所示，作者发现某些突变会使得开放或封闭构象的侧链构型发生改变，因此两种状态的能量发生显著分化。为避免这些具有状态依赖性（state-dependent）的突变影响构象转化平衡，作者剔除了使某一构象不稳定的突变，得到了设计集X.3。进一步，作者通过高斯网络模型（GNM）计算发现，在铰链（hinge）区或叶瓣界面（lobe interface）区的突变会显著影响骨架堆积密度，这对设计更耐热的动态蛋白是不利的。因此，作者剔除了在这些区域的突变，最终得到了设计集X.4。
图2. PBP单状态设计突变的ΔΔG和堆积密度分析。
如图3和表1所示，作者测试了这些蛋白质的热变性温度Tm，并利用等温滴定量热法（ITC）测试了小分子解离常数KD。结果表明，单状态设计和双状态设计均能提高PBP的热稳定性，但是单状态设计集X.1、X.2中的KD高于野生型5倍，而双状态设计集X.4中KD基本不变，这说明双状态设计策略能够在提高Tm的同时维持蛋白活性不变，因此在动态蛋白的耐热性设计上更具有优势。
图3. 野生型和突变型PBP的热稳定性和结合力表征结果。
表1. 野生型和突变型PBP的Tm和KD测量结果。
总的来说，作者在PROSS软件的基础上采用双状态分析策略，成功设计了更耐热的PBP，这为动态蛋白的耐热性设计提供了新的思路。作者认为，如果能够进一步结合如AlphaFold等机器学习方法，双状态设计策略有望拓宽到更多动态蛋白体系中。
作者：CHR 审校：QJC
DOI: 10.1021/jacs.5c19571
