介绍一篇发表在Nature Communications的文章“Proteomic sensors for quantitative multiplexed and spatial monitoring of kinase signaling”，通讯作者是来自康奈尔大学的Marcus B. Smolka教授，其主要研究方向是基因组学和激酶-磷酸化蛋白质组学。本文介绍了一种名为 ProKAS（Proteomic Kinase Activity Sensor）的蛋白质组学技术，旨在实现对细胞内蛋白激酶活性的多重定量和空间分辨监测。

蛋白激酶在细胞信号转导中扮演核心角色，其活性调控涉及多种生理与病理过程，如DNA损伤应答、细胞周期调控和肿瘤发生。传统方法如质谱磷酸化蛋白质组、抗体检测或荧光生物传感器在空间分辨率、多重检测能力或定量精度方面存在局限。而本文设计的ProKAS旨在整合质谱检测的高通量与肽段传感器的灵活性，系统解析激酶信号网络。

ProKAS 的设计核心是设计表达生物传感器的质粒，其组成成分包括：（1）荧光蛋白GFP；（2）亚细胞定位靶向原件（targetingelement，TE）如核定位信号NLS或胞质定位信号 NES）；（3）名为MKS（Multiplexed Kinase Sensor）的多肽模块，每段包含10–15个氨基酸的肽段序列，每个序列代表特定激酶的底物，并带有独特的N端氨基酸条形码（barcode）用于区分不同激酶或亚细胞定位；（4）ALFA纯化标签。在实验中，将ProKAS质粒转染至细胞，经药物或遗传刺激后裂解细胞，ALFA标签进行亲和纯化，胰蛋白酶消化后，质谱检测磷酸化与未磷酸化肽段的相对丰度，即可通过条形码区分不同激酶，并利用荧光蛋白将质谱肽信号与相应的细胞位置相匹配。

在实验中，作者首先以ATR为范例，展示如何从已知底物中挖掘高特异性传感器。作者在组学数据中筛选出ATR特异性磷酸化位点（如FANCD2-S717），将该位点周围13个氨基酸克隆入ProKAS，发现经羟基脲（HU）刺激后，传感器磷酸化显著上升，而ATR抑制剂（AZD6738）可完全阻断该磷酸化，验证该方法的特异性与诱导性。随后，针对缺乏已知底物的激酶，作者开发计算设计平台，基于303种激酶的肽段偏好数据（PSPA），利用遗传算法从头设计高特异性底物肽段，并通过实验筛选验证磷酸化水平并评估特异性。在此基础上，作者还将多个传感器整合为一条多肽链，实现了单样本多重激酶活性监测，并用于药物筛选与动力学分析。

接下来，作者利用不同定位信号将ProKAS靶向不同亚细胞区域，首次定量比较激酶在核和胞质的活性差异，表征了ATR/ATM/CHK1三种激酶活性，发现在无刺激和不同刺激条件下，三种激酶在不同亚细胞区域的活性变化存在显著差异。其中值得注意的是，ATM不在复制工厂被激活，不参与复制叉阻滞应答，但在DSB诱导下存在胞质激活模式，提示其存在此前未发现的潜在非核功能。最后，作者还尝试通过增加传感器、条形码与TMT标记等方式升级ProKAS，实现数十种激酶、数百种条件的同时分析，使其适用于系统生物学与药物筛选。

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总的来说，本文建立了ProKAS这一方法，并在基础设计上逐步构建起高通量、定量、空间分辨的激酶活性监测平台，为解析复杂信号网络与药物机制提供了全新工具。

本文作者：FTY

责任编辑：MB

DOI：10.1038/s41467-025-65950-2

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-025-65950-2