分享一篇发表在Redox Biology上的文章，题目为”3S-DB identifies an RNA repository facilitating stop codon readthrough for selenocysteine insertion and selenoproteome expansion”。通讯作者是中国科学院上海有机化学研究所的Bing Shan和Yaoyang Zhang教授，课题组专注于氧化还原生物学和硒蛋白研究。

硒蛋白是一类含有硒代半胱氨酸（Sec）的特殊蛋白质，Sec由通常作为终止信号的UGA密码子通过通读机制插入，依赖于3’非翻译区（UTR）的SECIS元素和SECIS结合蛋白2（SECISBP2）。硒蛋白在氧化还原调节、抗氧化防御和细胞铁死亡等生理过程中发挥关键作用。目前人类硒蛋白组仅已知25个成员，其鉴定主要依赖SECIS元素的生物信息学预测，但该方法存在局限性，可能遗漏非典型SECIS结构或新型硒蛋白。

为解决这一难题，本研究采用RNA免疫沉淀测序（RIP-Seq）技术，聚焦SECISBP2蛋白，直接捕获其结合的所有RNA分子，构建了名为3S-DB的数据库。实验设计上，作者在HEK 293T细胞中过表达FLAG标签的SECISBP2蛋白，通过抗FLAG抗体进行免疫沉淀，提取结合RNA进行高通量测序。作为对照，使用空载载体处理的细胞进行平行实验。结果显示，SECISBP2-RIP-Seq显著富集了已知硒蛋白（如GPX1、GPX4和SELENOW）的mRNA，而看家基因（如GAPDH和actin）未被富集，证实了方法的特异性。

通过生物信息学分析，作者从测序数据中鉴定出1333个SECISBP2结合RNA，并将其分为高置信度（G1）、中置信度（G2）和低置信度（G3）组。其中G1组包含269个RNA，包括18个已知硒蛋白转录本，其富集倍数超过3倍且统计显著。数据库分析揭示这些RNA的停止密码子分布（UGA约占50%）、GC含量和染色体位置等特征与已知硒蛋白类似，功能富集分析显示它们参与氧化应激响应和线粒体功能等通路，与硒蛋白生物学角色一致。

为验证3S-DB中RNA的SECIS活性，作者选取ATP5MJ和PDF等候选基因进行功能实验。通过荧光素酶报告系统，将候选RNA片段融合到含UGA密码子的荧光素酶基因3’UTR，测量Sec插入效率。结果表明，ATP5MJ的片段4和5（ATP5MJ-F4,5）及PDF的片段2（PDF-F2）能显著增强荧光素酶活性，效率接近阳性对照GPX1的SECIS元素，而片段删除则导致活性下降，证实这些片段具有SECIS功能。此外，Western blot分析显示，将这些片段嵌入已知硒蛋白（如GPX1和MSRB1）的3’UTR后，能促进全长硒蛋白表达，质谱鉴定到Sec修饰肽段，进一步支持其活性。

讨论部分指出，3S-DB数据库通过实验驱动方式提供了硒蛋白研究的宝贵资源，不仅证实了已知硒蛋白机制，还揭示了新型SECIS元素的存在。尽管部分候选RNA在体内Sec插入效率较低，可能受UGA上下文、翻译因子可用性等因素影响，但这项工作拓展了对终止密码子通读机制的理解，为发现“暗硒蛋白组”和开发相关治疗策略奠定基础。未来通过整合交叉linking免疫沉淀（CLIP）等高分辨率技术，可进一步精细映射SECISBP2结合位点。

总之，本研究开发的3S-DB数据库和RIP-Seq策略为硒蛋白组学提供了新工具，有望推动氧化还原生物学和疾病机制研究。数据库资源已公开，促进社区共享和后续探索。

本文作者：TZS

责任编辑：WYQ

DOI：10.1016/j.redox.2025.103888

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.redox.2025.103888