克拉伯病（Krabbe disease）是由于β-半乳糖脑苷脂酶（GALC）功能的丧失导致神经代谢紊乱，β-半乳糖脑苷脂酶属于GH59家族酶，催化糖鞘脂中的半乳糖脑苷脂糖苷键水解形成β-半乳糖和神经酰胺；同时也可以催化鞘氨醇半乳糖苷水解产生β-半乳糖和鞘氨醇。最近，药物伴侣疗法已成为一种有前途的治疗克拉伯病的替代或补充方法。该方法是通过结合一个稳定的小分子，以阻止GALC在到达溶酶体之前发生降解。这些小分子作为抑制剂用来模拟底物在米氏复合体或酶反应过渡状态下的构象。因此，了解GALC的催化机制对于促进克拉伯病治疗中高效构象伴侣的开发具有重要意义。近期，西班牙巴塞罗那大学的Carme Rovira课题组通过QM/MM计算结合分子动力学模拟揭示了GALC催化的分子机制。
图片来源：ACS Catal.
首先以报道的GALC-Gal-β-pNP复合物结构作为模拟的起始结构，经典MD模拟表明两个催化残基朝着正确的催化方向的系统是稳定的，同时β-半乳糖基环在整个模拟过程中仍保持4C1构象。然而，不能排除可能有替代构象（在平衡MD期间未被发现）可能与松弛的4C1构象竞争。
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为了进一步探究底物的构象，并考察活性部位是否存在其他可能的稳定构象，该研究利用QM/MM元动力学计算了β-半乳糖环相对于Cremer&Pople的θ和ψ折叠坐标的构象自由能景观图（FEL）。由元动力学模拟重建的FEL表明，不仅4C1构象对应一个自由能最小值，还有一个靠近1S3构象的相关最小值。
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从模拟1S3构象开始的反应自由能图表明，该体系在一个只有一个过渡态（TS）的协同路径中向糖基-酶中间体（GEI）演化。化学反应开始于糖苷键（C1−O1’）的伸长，而糖环在到达反应TS时构象从1S3变为4H3。
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综上所述，该研究发现GALC的活性位点可以以1S3和4C1两种不同的构象来调节β-半乳糖苷酶底物。水解反应可以通过这两种构象中的任何一种发生，导致两种截然不同的催化路线：1S3→[4H3]⧧→4C1和4C1→[4H3]⧧→4C1。因此，研究结果不仅增加了对GALC作用机制的理解，而且还为设计糖类似物（4C1、1S3和4H3）提供了可作为治疗Krabbe病的伴侣分子的构象。
参考文献：The Catalytic Reaction Mechanism of the β‑Galactocerebrosidase Enzyme Deficient in Krabbe Disease
ACS Catal.
DOI: 10.1021/acscatal.0c02609
原文作者：Alba Nin-Hill and Carme Rovira*
