摘要：
监管机构要求生物制药行业证明可能从生产系统中迁移出来的可提取物不会改变药品的安全性、功效、效力或纯度。生产系统，尤其是一次性系统中使用的聚合材料的可提取物研究旨在显示材料安全性，并应支持用户对在工艺条件下可能进入最终产品的可浸出物进行基于风险的毒理学评估。在本文中，我们打算增进大家对于溶剂-聚合物相互作用的理解，从而能根据其化学性质，从一系列提取液中预测可提取物。本文介绍了基于溶解度参数预测生物制药应用中溶剂与聚合物相互作用和聚合物溶胀（polymer swelling）的可能性。
1.引言
监管机构要求生物制药行业证明可能从生产系统迁移到工艺流中的可提取物不会改变药物产品的安全性、功效、效力或纯度。与食品行业制定了标准化的提取条件不同的是，在制药应用中应考虑到预期用途可能存在差异特别大的使用条件相对应，因此有必要在相应的条件下进行药物接触材料的可提取物研究。为了进行合理的材料鉴定和风险评估，在可提取物研究中，常用的溶剂倾向于从塑料中萃取可浸出物，其强度要比药物接触液剧烈。可提取物研究是在最极端情况下（worst-case conditions），高温和高材料/溶剂比（material/solvent ratios）的条件下进行的。因此，通过一些建议的研究策略，将可提取物研究中的提取条件与工艺条件联系起来。这些方法虽然符合当局的期望，但或多或少忽略了潜在的物理和化学的相互作用。在本文中，我们计划增进大家对于溶剂-聚合物相互作用的理解，从而允许根据提取液的化学性质从一系列提取液中预测可提取物。利用溶剂和塑料的基本化学性质，可以使用一小组溶剂来模拟一系列工艺溶液的可提取物清单。
选择一种具有理想的物理性能组合以满足特定应用需求的溶剂或溶剂混合物的任务已可通过一系列实验研究得以解决。已有人提出利用现有模型、使用计算机辅助来预测聚合物混溶性的概念，从而将溶剂搜索从实验室转移到桌面。但是，我们要强调的是，我们并非打算使用计算机辅助做完所有的工作，因为我们认为我们的选择并非完全不受限制。在食品接触和制药领域，行业和监管机构已提出了大量指导意见。
可提取物研究的目的是对食品和生物制药行业中使用的聚乙烯，、聚丙烯、聚乙烯-醋酸乙烯酯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚醚砜和醋酸纤维素制成的塑料零件进行化学表征（chemical characterization）。从聚烯烃基聚合物提取物中提取的过程中会发现不同的化合物，包括低聚物、添加剂和添加剂衍生物、酮、醛、酯等。根据最差条件的一般可提取物研究要求，我们认为平衡条件是相关的，因为平衡条件代表了给定材料-溶剂体系中最大可达到的浓度。在下面的研究中，我们不仅关注提取物释放的动力学方面，还包括动力学方面在内的综合方法，此类研究和评论可以在其他领域找到广泛的共性的存在。
这项研究的目的是提供一种基于科学的、务实的溶剂选择方法，以进行可提取物的研究，同时并行考虑行业组织（BPSA，PDA，BPOG，PQRI，ASME BPE），标准组织和监管机构（USP，ASTM，EU指令，英国法令，美国FDA）。目前的实践策略是将乙醇和异丙醇等醇类及其与水的混合物作为生物制药和食品包装的首选溶剂。同样，在制药领域也有建议使用酸性和酸性的水-乙醇混合物和碱性溶液的建议。我们的目标是确定提取方案，该方案应涵盖整个生物制药过程，并且可以支持生物制药行业和供应商行业的需求。我们建议的溶剂选择是基于文献信息中的溶剂的物理化学参数和实际情况而定。考虑的选择标准包括使用能将特定化合物提取出来的提取液，并且此提取液无需花费大量精力进行样品制备/样品处理、对分析过程的结果影响最小的溶剂，以及该溶剂能覆盖（bracketing）生物制药中的条件。除了理论上的考虑外，我们还提供了最近可提取物实验的结果，这些实验证明了几种溶剂对可提取物数据的影响。
2. 材料和方法
我们采用了代表性的塑料，将它们暴露于可能的提取溶剂中，然后通过以下分析方法对提取物进行分析。
2.1 PE薄膜，EVA薄膜，油管和囊式滤膜。
多层膜样品的结构如图1所示。PET膜依次由聚乙烯（PE），乙烯乙烯醇（EVOH），聚酰胺（PA）和聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）组成，厚度约为200μm。EVA膜由乙烯醋酸乙烯酯（EVA）和EVOH组成，厚度约为360μm。PE膜依次由PE（内部），EVOH和PE（外部）组成，厚度约为400μm。TPE管是TPE的单一材料，硬度肖氏硬度A为50-60。硅胶管是Si（Pt）的单一材料，硬度为50-60 Shore A。两个管的内径均为13 mm，外径为19 mm，盖子和适配器由聚丙烯制成。可以使用由PES（聚醚砜），CA（醋酸纤维素），ePTFE（聚四氟乙烯），PP（聚丙烯）制成的单层或多层膜或由PP制成的无纺过滤器来制备过滤介质。支撑介质可以由PP或PET制成。滤膜盒由滤芯和聚丙烯外壳制成。
2.2 γ射线辐照。
将PE薄膜，PET薄膜和EVA薄膜的袋腔包装并包装在特定的包装（PE）中，并在室温下用60Co γ射线源进行γ辐射。以50±1kGy能量照射所有样品。在γ射线照射后约5天，对膜样品进行第一次分析。囊式滤芯以50±2 kGy进行γ射线照射。
2.3 萃取。
第一种提取系列。在加速条件下（按照ASTM F1980-99，即40°C，112天，Q10 = 2），用13种不同的溶液提取1年。它们是3 M NaOH，1 M HCl，20×DPBS，20％乙醇，8 M胍，纯水，纯乙醇，10％DMSO，1％聚山梨酯80、4 M NaCl，1 M HCl，1 MNaOH和4 M（NH4）2SO4。溶剂存储在由体积比为1.5-1.8 cm2 / mL的EVA膜或体积比为1.5-1.9 cm2 / mL的PE膜制成的袋中。20倍DPBS（改良的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水）是不同盐的混合物（用水稀释至1倍时）：为8 mM磷酸钠，2 mM磷酸钾，0.14 M NaCl，10 mM KCl，pH 7.4。
第二种提取系列。用纯水作为助溶剂评估了0至100％的不同乙醇浓度。在40°C的袋室中进行提取4天，该室由体积比为1.8 cm2 / mL的EVA膜或体积比为1.9 cm2 / mL的PE膜制成。将TPE管和硅树脂管在40°C下浸入具有不同乙醇含量的溶液中，浸入比例为1.5 cm2 / mL约4天。
2.4 检测。
本文介绍的应用检测方法是文献中所述的广泛使用的标准方法。检测方法不在本文讨论范围之内。
GC-MS / FID
乙醇样品直接进样至GC中。在进行GC-MS/ FID分析之前，将水萃取液在中pH，低pH和高pH下以环己酮-2,2,6,6-d4作为内标物萃取到二氯甲烷（DCM）中。DCM提取物可随后在GC-MS/FID分析之前进行浓缩。将一微升DCM注入GC-MS/FID。在分析之前，将内标2-氟-1,1'-联苯或甲苯-d8添加到每个样品中，以便于定量估计潜在的可提取物。提取物中存在的可提取物是通过对质谱与质谱的NIST参考库进行最佳拟合分析而确定的。将每种溶液注入配备有色谱柱（DB-5MS，60 m×0.25 mm×0.25μm）的GC-MS / FID（安捷伦质量选择检测器和火焰电离检测器）中。GC-MS / FID的报告极限为0.05μg/ mL。
顶空GC-MS / FID
通过Headspace-GC-MS / FID分析纯净水样品，并加入10μg/ mL甲苯-d8溶液作为内标，以利于定量评估潜在可提取物。将顶空样品瓶加热到80°C，然后将顶空内容物转移至GC-MS / FID进行分析和鉴定。每种水提物均在配备顶空系统（PerkinElmer Turbomatrix 16）和色谱柱（Elite 5MS，60 m× 0.25毫米×0.25微米）。顶空-GCMS / FID的报告极限为0.01μg/ mL。
HPLC-UV-MS
HPLC-UV-MS方法利用反相色谱柱（C18）和乙腈和10 mM醋酸铵在水中的梯度流动相以及UV-vis二极管阵列检测器（DAD）和单四极质谱仪（Agilent UV /可见二极管阵列检测器，波长220 nm）。将含80％乙醇，10％DMSO，纯乙醇和纯水的样品直接进样。将1 M NaOH，1 M HCl，4 M（NH4）2SO4、4 M NaCl和1％聚山梨酯80的样品通过SPE转移到有机相中。此外，在每次运行中都直接分析了潜在的具有高毒性的可提取物的外标。为了获得可靠性并避免溶剂/基质效应，使用MS检测器使用萃取离子模式监测了几种潜在的可提取物进行检测。表1SI中列出的清单是欧洲药典（3.1.13）中列出的可以预期从袋子中提取的抗氧化剂。除非稍后另有说明，否则所有化合物的报告限值均为0.05μg/ mL。对于BPA，2,4,8,10-四氧杂-3,9-二磷酸环（5.5）十一烷，3,9-双（十八烷氧基）-和BHT为0.5μg/ mL。2,6-二叔丁基-1,4-苯醌的浓度为6μg/mL。我们精心设计了适当且可重现的分析方法，即使在必要时也可以追踪痕量目标化合物。
ICP-MS
适当准备样品后，通过ICP-MS分析80％的乙醇，1 M NaOH，1 M HCl，1％的聚山梨酸酯，10％DMSO，纯乙醇和纯水样品。没有分析1 M NaOH样品中钠的存在，因为高浓度钠存在于样品基质中。使用Agilent7500质量选择检测器对元素进行了分析，报告限为0.05μg/ mL（硅含量为1μg/ mL）。监测了以下元素：铝，锑，砷，钡，铋，硼，镉，钙，铬，钴，铜，铁，铅，锂，镁，锰，钼，镍，磷，铂，钾，硅，银，钠，锶，锡，钛，钒，锌
离子色谱（IC）
IC使用Thermo Scientific仪器ICS5000进行。检测表2SI中列出的每种酸。使用AS15毛细管柱跟踪乙酸，2-羟基丙酸，马来酸，己酸，并使用AS19 4 mm柱跟踪列出的所有其他酸。使用梯度氢氧化钾来进行检测。该检测是通过电导检测器实现的。在纯水中的报告极限为0.05μg/ mL。乙醇提取物的报告极限为0.1μg/ mL。
3.理论上的考虑
我们选择以下标准来选择适合提取物实验的溶剂：
（a）溶剂应溶解典型的可提取物，而无任何溶解度限制。聚合物和溶剂之间的可提取物的低分配系数是优先选择的。溶剂不应破坏聚合物，而应允许酸性和碱性相互作用，并且它们可能会增加水中可提取物（如含盐溶液）的溶解度。
（b）溶剂应满足一些实际要求，例如提供高于40°C的沸点并且易于应用于分析方法。为了在加速条件下进行可提取物的研究，根据生物制药工艺和材料特性，萃取必须在40°C或更高的温度下进行。由于实验（溶剂损失）和安全原因，不能使用沸点低于或接近40°C的溶剂。
3.1提取物的溶解度。
萃取是从固相化合物（已知系统不平衡）进入液体的过程。选择萃取溶剂的第一个要求是知道化合物如何在聚合物相和液相之间分配。我们希望这个过程是不涉及化学反应。
3.1.1与小有机化合物的溶剂相互作用。
溶剂和溶解性化合物之间的相互作用可以用格言“像溶解一样”来描述。极性分子溶解在极性溶剂中，非极性分子溶解在非极性溶剂中。大多数有机分子是相对非极性的，通常可溶于有机溶剂（例如乙醚，二氯甲烷等），但不溶于极性溶剂（如水）。
溶剂的极性与溶剂的介电常数有关。介电常数是溶剂分离离子电荷能力的量度。介电常数不是极性的唯一量度，对理解该论文中的溶质/溶剂相互作用没有帮助。质子传递溶剂（例如水）通过氢键牢固地将阴离子（带负电的溶质）溶剂化。非质子传递溶剂倾向于具有较大的偶极矩，并通过其负偶极溶剂化带正电荷的物质。丙酮和二甲基亚砜是非质子传递溶剂。最后，可以将常见溶剂分为不同的类别，图1SI中列出了某些溶剂的性质。对于有机化合物，介电常数与分子量相关。酯的介电常数远低于醇（在30-130 Da范围内分别为33-10）和酮（在60-110 Da下分别为20-13）的介电常数。极性的详细表格可在参考文献38中找到。
水的强极性在25°C下的介电常数表示为78.3。因此，水不能被视为聚合物及其低聚物的良好溶剂。我们期望长烃和长羧酸不溶于水。需要增加在水中可混溶的长有机化合物的极性。纯净的水只能溶解亲水性化合物，例如低分子量的醇，酮，醛，酰胺，酯和醚。这些化合物在水中的积累当然受到分配系数的限制，这将在本文的后面进行讨论。某些化合物的辛醇/水分配系数也可从文献中获得。但是，通过模仿了生物制药的应用条件直到几个星期或几个月，水溶液中非极性有机化合物（如烷烃）的积累仍不会达到可提取物研究中可以检测到的浓度。在多层膜材料的情况下尤其如此，因为分层结构可能会阻碍可浸出物的迁移。
3.1.2分配系数。
在较长的提取时间内，可以预期在聚合物相和液相之间达到平衡，可以用等式1表示：
可以将其重新排列为有限系统，其中mo = mp + ml，那么公式变化为：
其中：Kp/l，可提取物在聚合物和液相之间的分配系数；Cp，聚合物相中可提取物的浓度；Cl，液相中可提取物的浓度；mp，聚合物相中可提取物的质量；ml，液相中可提取物的质量；mtot，聚合物中可提取物的原始量（即，在开始萃取实验之前，其中mtot = mp +ml）；Vp，聚合物体积；Vl，液相体积。
平衡浓度等于给定系统在给定温度（此处为40°C）和压力（此处为环境温度）下可以达到的可萃取化合物的最大浓度。达到可提取物最大或平衡浓度的速度取决于聚合物中的扩散和扩散影响参数（即时间，温度和样品几何形状）。因此，最坏情况下的可提取物实验应使用给定系统中目标提取物的低分配系数Kp / l的溶剂和溶剂系统。在这些热力学条件下进行的可提取物实验应可以让用户来确定平衡条件。因此，我们研究了萃取温度（23°C、40°C和60°C）对从薄膜释放到乙醇接触液中的可提取物的影响。提取过程是吸热的，可以通过提高温度来加速。由于我们的提取物研究是在环境条件下进行的，因此未研究压力的影响。
我们在表3SI中收集并计算了LDPE/ EtOH系统中选定化学品的分配系数。对于水溶液而言，Kp / l表明，大多数来自塑料的化合物将主要残留在塑料中，并且这些化合物的浓度可能较低。
3.1.3 pH值对化合物从聚合物分配到水溶液中的分配的影响。
溶质pH对可提取物浓度的影响已在文献中进行了讨论。一个合适的方程式，可根据可被去质子化（例如酚有机酸）或质子化（例如胺类）的化合物的pH值计算表观分配系数。
Kp/l(pH)=Kp/l / [1+10(pH-pKa)]
其中：Kp / l，可提取物在聚合物和液相之间的分配系数；Kp / l（pH），聚合物与液相之间可提取物的分配系数与pH值的关系；pH，溶液的pH；pKa，所考虑化合物的pKa值。
如果不溶于水的化合物可以通过用酸或碱处理而形成离子物种，则它们可以在水性环境中变得可溶。羧酸（pKa = 3-5）和苯酚（pKa = 9-10）在苛性碱溶液中的溶解性是由于极性（离子）羧酸盐或酚基的形成，因为它们比水（pKa）强得多（水pKa大约为15）。胺在稀酸水溶液中的溶解度类似地反映了以下事实：它们是比水更强的碱，并通过质子化转化为极性铵离子。胺是在稀酸水溶液中质子化的唯一一类常见的有机化合物。
3.1.4水改性剂。
离液剂和促渗剂的作用与其对水的结构和亲脂性的影响有关。硫酸铵（（NH4）2SO4）在水溶液中起同调盐的作用。胍盐用作离液剂，有助于将非极性基团转移到水中，并增加颗粒蛋白和非电解质（如醇）的水溶性。尽管聚合物主要是非极性的，但人们可能希望高浓度的胍能促进溶剂化聚合物副产物。高盐浓缩的促渗溶液很可能会提取亲水性有机物质，通常用作细胞培养的中性等渗缓冲液的各种盐的混合物也可能促进亲水性有机物质的提取。
还可以通过使用表面活性剂如非离子表面活性剂聚山梨酯80来改变水的物理化学性质。水中1％的聚山梨酯80的临界胶束浓度为0.012mM以上，可以使有机溶剂良好地溶解将分子溶解到水性介质中。1％的聚山梨酯80溶液作为水不会使PE，PP和EVA溶胀。
