今天给大家分享一篇今年4月份发表在Journal of the American Chemical Society上的文章，文章题目为：Proximity Histidine Labeling by Umpolung Strategy Using SingletOxygen. (DOI: 10.1021/jacs.1c01626) 文章的通讯作者是来自于东北大学的Shinichi Sato教授，其课题组的研究方向主要为：开发生物偶联策略合成新的生物材料用于临床诊断和工业生产。
与天然蛋白质形成不可逆共价键是分析生命系统和创造基于蛋白质的新型生物材料的重要手段。利用亲电基团修饰亲核氨基酸残基作为纯化蛋白的传统方法而被广泛应用。与之相比，靶向亲核氨基酸的标记方法开发较少，因而具有巨大的研究前景，近年来广受关注。与此同时，近位依赖性标记(proximity-dependent labeling，PDL)技术逐渐应用到蛋白质标记中去，已成为映射蛋白-蛋白相互作用和位点选择性标记的有力方法。单线态氧(1O2)是一种由光催化剂产生的高活性氧物种，主要进行空间受限的氧化。组氨酸残基是1O2诱导氧化的主要靶点之一，Diels−Alder加成可将1O2加到组氨酸咪唑环上，产生一种亲电的内过氧化物中间体，称为“氧化组氨酸”。在本研究中，作者发现1-甲基-4-芳基尿唑(MAUra)是氧化组氨酸的高效和选择性捕捉剂(如图1)。早期的方法利用组氨酸残基的亲核性，而当前的方法是利用与1O2反应产生的组氨酸氧化中间体的亲电性的极性转换策略。相反，作者之前也报道了MAUra在单电子转移(SET)条件下标记酪氨酸残基。于是，作者使用同时催化1O2生成和SET两种不同类型的空间限制氧化反应的钌催化剂，进行了光催化剂邻近标记抗体Fc域的位点选择性标记研究。
图2：rose bengal与含有组氨酸多肽的反应途径与质谱依据。
而后，作者考虑到单线态氧具有活性很高但扩散半径小的特点，于是将该标记策略应用于邻近标记中。作者在磁珠上安装了Fc配体（Fc结合肽或者蛋白A的非肽类似物ApA）以及钌/4,4-二羧基联吡啶的光催化剂，对曲妥珠单抗进行标记。由于反应中的MAUra衍生出了一个叠氮基团，进一步可以通过点击化学反应连接荧光基团，通过跑胶检测标记实验是否成功。可以看到同时偶联ApA和光催化剂的磁珠上会产生明显的荧光标记，且出现在靠近磁珠的Fc端，而非距离较远的Fab端，说明该策略可以实现有效的邻近标记。
图3：基于纳米级磁珠的邻近标记策略（Fc键合配体：吸引包含组氨酸的蛋白——曲妥珠单抗；Ru光氧化催化剂：产生1O2，用以氧化邻近组氨酸。）
最后，作者对标记蛋白进行酶解，确认这些标记是发生在组氨酸上。进而发现，这种标记策略不仅依赖于距离，同时也依赖于氨基酸的暴露程度。
