多肽合成中氨基酸的消旋问题

多肽键生成中的外消旋化一直是多肽化学中困扰化学工作者的一个主要难题，也是多肽化学研究的热点之一。肽键的形成需要将羧酸活化，活化后的羧酸中间体，以及后续的缩合过程都有可能导致外消旋化。深入研究发现，这种外消旋化有两种机制^[1]。第一种机制是直接消旋化——从α碳直接攫取氢质子（Path A）；第二种机制经历恶唑环的过程——恶唑环的α氢质子被攫取（Path B）。

Figure 1 外消旋机制：（A）直接消旋；（B）经恶唑环消旋

影响肽键外消旋化的因素主要有以下几个：（1）碱的因素；（2）添加剂因素；（3）缩合剂的因素；（4）其他因素。本文拟对上述因素进行简单的总结。

（1）碱的因素

Table 1氨基酸N-羧酸酐（NCA）衍生物的消旋速率^[2]

注：4-MM：4-甲基吗啉；4-EM：4-乙基吗啉

Carpino等人在上世纪九十年代就发现，有机碱的碱性和立体位阻对外消旋有很大的影响^[3]。多肽缩合反应中使用最为广泛的有机碱是：N,N-二异丙基乙胺（DIEA），N-甲基吗啡啉（NMM）和2,4,6-三甲基吡啶（TMP，Collidine）。其中，N,N-二异丙基乙胺碱性较强（pKa 10.1），N-甲基吗啡啉（pKa 7.38）和2,4,6-三甲基吡啶（pKa 7.43）较弱。由于2,4,6-三甲基吡啶（TMP，Collidine）的立体位阻更大，因此在很多肽键形成中，使用2,4,6-三甲基吡啶（TMP）产生的消旋产物更少。另外，平时常用的三乙胺由于其位阻较小碱性较强，外消旋速率比N,N-二异丙基乙胺和N-甲基吗啡啉都要更快（Table 1）^[2]。Table 2展示了氨基酸的N-羧酸酐衍生物与不同的有机碱消旋化之后再与苄胺缩合的结果^[2]。该结果显示2,4,6-三甲基吡啶（TMP，Collidine）产生的消旋产物最少。

Table 2氨基酸N-羧酸酐（NCA）的消旋及其与苄胺的反应[2]

注：4-EM：4-乙基吗啉；4-ChxM：4-环己基吗啉

在另外一篇报道中，Carpino等人发现在多肽片段偶联时，也有类似的结果——2,4,6-三甲基吡啶（TMP，Collidine）产生的消旋产物最少（Table 3）^[3a]！在该反应中一个二肽Z-Phe-Val-OH与丙氨酸甲酯盐酸盐（H-Ala-OMe^.HCl）的缩合，不管用哪个缩合剂，TMP的消旋总是最少的。

Table 3 Z-Phe-Val-Ala-OMe肽片段合成（2+1）的消旋情况^[3a]

注：PS：质子海绵；缩合剂的具体结构参见Table 7。

（2）添加剂因素

Figure 2 苯并三氮唑类添加剂在缩合反应中的作用

在多肽合成中，加入添加剂是一种常见方法，可以提高收率，减少消旋的副反应——尤其在使用碳二亚胺类型的缩合剂，例如DIC时候，加入添加剂显得尤为重要。目前，常用添加剂主要是一些苯并三氮唑类化合物（HOXt），主要包括：HOBt^[4]、HOAt^[5]和6-Cl-HOBt^[6]（Figure 2）。这类苯并三氮唑化合物具有较强的酸性（pKa for HOBt: 4.60, pKa for HOAt: 3.28, pKafor 6-Cl-HOBt: 3.35）^[7]，它们能够与羧酸形成活性中间体。我们知道与碳二亚胺类缩合剂也可以和羧酸形成的活性中间体——O-酰异脲化合物。但是和O-酰异脲化合物相比，苯并三氮唑与羧酸形成的活性中间体更加稳定，可以避免O-酰异脲化合物重排成N-酰异脲化合物从而失去反应活性（Figure 2）^[8]。在上述三个添加剂中，HOBt活性最差，消旋副反应通常是也最多的。HOAt活性最好，消旋的副反应也最少。HOAt吡啶环上7位氮原子发生的邻位参与效应是其高活性关键因素（Figure 3）。但不幸的是，HOAt价格也是最昂贵的。6-Cl-HOBt的活性比HOBt略好，生产成本比HOAt稍低，是这三个里面“性价比”最均衡。虽然苯并三氮唑类添加剂是目前最常用的，但是研究发现苯并三氮唑类化合物具有易爆炸的风险^[9]。目前这类化合物已被归为I类爆炸品，其生产、运输和使用都具有较高的风险。

Figure 3 HOAt的邻位参与效应以及2-肟氰乙酸乙酯和1,3-二甲基紫丁酸的化学结构

近年来，一些含肟的新型添加剂被Albericio小组开发出来，成功地应用于肽键的合成。最重要的两个添加剂是：2-肟氰乙酸乙酯（OxymaPure）^[10]和1,3-二甲基紫丁酸（Oxyma-B）^[11]。在与碳二亚胺类缩合剂DIC联用的时候，2-肟氰乙酸乙酯和1,3-二甲基紫丁酸的缩合产率与HOAt相当，但是消旋的副反应更少（Table 4）^[11]。在更有挑战性的肽片段[2+1]缩合反应中，2-肟氰乙酸乙酯和1,3-二甲基紫丁酸也表现出优于HOBt的抑制消旋化的效果（Table 5）^[11]。在进一步验证消旋化的实验中，Albericio等人利用固相合成制备几个三肽化合物。这几个三肽含有一些特别容易发生消旋化的氨基酸——丝氨酸（Ser），半胱氨酸（Cys）和组氨酸（His）。研究发现1,3-二甲基紫丁酸（Oxyma-B）对于抑制消旋的效果最好，甚至优于HOAt和2-肟氰乙酸乙酯（OxymaPure）（Table 6）^[11]。

Table 4Z-Phg-Pro-NH₂的合成（固相合成）^[11]

Table 5 二肽Z-Phe-Val-OH与H-Pro-NH₂的缩合（溶液相合成）^[11]

Table 6 对三肽H-Gly-AA-Phe-NH₂（AA = Ser、Cys、Cys（Acm）或His）固相合成中的消旋研究^[11]

（3）缩合剂的因素

缩合试剂结构多变、种类繁多，琳琅满目，主要包括以下几类：碳二亚胺类、铵盐类、磷盐类、吡啶盐类、喹啉类、磷酸酯类等。本文前面介绍的几种添加剂（HOXt、OxymaPure、Oxyma-B）都可以与一些铵盐类或磷盐结合，成为独立的缩合剂。由于缩合试剂种类繁多，我们把一部分常见的和本文涉及到的缩合剂整理在Table 7里面。

Table 7 常见的缩合剂——缩写、结构、CAS号码与相对价格

类型	缩写	结构	CAS	相对价格
碳二亚胺类	DCC		538-75-0	低
	DIC		693-13-0	低
	EDC		25952-53-8	中
铵盐类	HATU		148893-10-1	高
	HBTU		94790-37-1	较高
	TATU		873798-09-5	高
	TBTU		125700-67-6	较高
	HAPyU		151679-96-8	高
	HBPyU		105379-24-6	较高
	HAMDU		154561-27-0	高
	HBMDU			高
	HDMA		958029-37-3	高
	HOTU		333717-40-1	较高
	COMU		1075198-30-9	高
	TFFH		164298-23-1	较高
膦盐类	PyBOP		128625-52-5	较高
	PyAOP		156311-83-0	高
	PyBrOP		132705-51-2	较高
	AOP		156311-85-2	高
	PyOxim
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