真菌能够产生结构多样且具有重要生物学意义的天然产物，是药物发现的重要资源之一。合成生物学或组合生物合成是生成非天然类似物的有力工具，通过异源宿主的基因组挖掘及目标天然产物生物合成途径的重建，可以理性地扩展目标天然产物的化学多样性，有利于药物筛选文库的建设(Figure 1)。
Figure 1. 利用合成生物学方法拓展目标生物活性天然产物的化学空间
真菌产生的十氢萘二萜吡喃酮(DDPs)是一种萜类天然产物，由萜类来源的十氢萘环体系和聚酮途径合成的吡喃酮相连而成(Figure 2)。目前只在真菌中发现过20多种DDPs，每一种DDP的结构差异都导致生物活性的不同，具有进一步开发的价值。
Figure 2. 真菌含十氢化萘二萜吡喃酮产物实例
目前，昆虫病原真菌绿僵菌中的DDP类化合物Subglutinols的生物合成基因簇(subA-F)已确定(Figure 3a)，其中非还原性聚酮合酶(NR-PKS)SubA、焦磷酸合成酶(GGPPS)SubD和异戊烯基转移酶(PT)SubC的功能已被报道。使用SubA(NR-PKS)作为探针，对公共数据库和原始基因资源进行基因组挖掘，在5个真菌基因组中发现了5个候选基因簇(Figure 3b)，基于氨基酸序列同源性对5个基因簇进行比较分析，并对其进行重新排序分析(Figure 3c)。经生物信息学预测代谢途径的分析，推断5个基因簇共享一个共同的中间产物4，随后再进入各自特异的途径以产生不同的终产物(Figure 3d)。
Figure 3. 基因组挖掘和DDP途径的设计。(a) 共同中间体4的合成途径；(b) 分布与五个真菌属的DDP生物合成基因簇；(c) 每个生物合成基因簇的比较分析；(d) 预测树状DDP生物合成途径
根据假设的生物合成途径，在宿主A. oryzae NSAR1中逐步引入生物合成基因。dpasACD引入宿主中产生了化合物2，进而引入dpasBE 到AO-dpasACD中产生了4；将FMO基因dpasF或BBE基因dpmaF导入AO-dpasACD中，重构了dpas和dpma基因簇而产生了5和6，且dpas基因簇产生了7。同时结果表明，DpasF和DpmaF都参与了C5单元的四氢呋喃(THF)环形成，而DpasF具有多步氧化的催化能力(Figure 4b)。为进一步分析dpch、dpmp和dpfg的生物合成途径，在AO-dpasABCDE的基础上引入dpmpG得到8，引入dpmpGH得到9。一系列结果表明，SDR1将底物C8位S羟基氧化成酮，SDR2将酮还原成8R羟基，实现构型的反转(Figure 4a)。将dpchGHF引入AO-dpasABCDE中，异源重组了dpch合成途径得到10。将dpmpI和dpfgI引入AO-dpasABCDE-dpmpGH中得到11，引入dpmpIJ和dpfgIJK构建完整的dpmp和dpfg基因簇分别得到12和13、14(Figure 4c)。以上结果表明，P450酶 DpmpJ将C-26甲基氧化成伯醇，DpfgJ在C-27催化三步氧化生成羧酸和C-26羟基化；DpfgI与DpmpI参与相同的甲基化，而DpfgK甲基化DpfgJ产生的羧酸(Figure 4c)。
Figure 4. DDP途径中的酶转化总结。(a) C-8立体化学反转；(b) C5单元的修饰；(c) 对吡喃酮环的改造；(d) 通过扩展途径产生的DDPs的结构；(e) DDP途径中修饰步骤的底物选择性总结
在天然的DDP生物合成基因簇中没有同时编码含有C5单元和吡喃酮部分修饰的酶途径，通过结合C5单元修饰途径和吡喃酮修饰途径来进行组合生物合成(Figure 3d)，产生有进一步的修饰非天然的DDP。选择dpasF作为额外的修饰基因，导入dpmp和dpfg基因簇中；此外将MT1(dpmpI)与dpas和dpch合成途径相连。至此在米曲霉中一共设计并重组了四种延伸途径(Figure 3d)，dpmp合成途径+dpasF产生了四个新的类似物(17、18、19和20)，dpfg合成途径+dpasF产生了新的类似物21，dpch合成途径+dpmpI产生了22，dpas合成途径+dpmpI产生了23、24、25(Figure 4d)。所有通过组合生物合成产生的非天然类似物都含有对C5单元和吡喃酮部分的修饰。
综上所述，本研究从五个真菌属中检索到五个不同的DDP生物合成基因簇，通过在米曲霉中重组五种天然途径、一种分流途径和四种延伸途径，产生了22种DDPs，包括15种新化合物，展示了合成生物学在真菌天然产物多样化方面是一个有力的工具。
本文通讯作者为日本东京大学Teigo Asai教授，主要研究领域为植物三萜类化合物生物合成及热带药用植物内生真菌生物活性代谢物的发现。
文章信息：Kento Tsukada, Shono Shinki, Akiho Kaneko, Kazuma Murakami, Kazuhiro Irie, Masatoshi Murai, Hideto Miyoshi, Shingo Dan, KumiKawaji, Hironori Hayashi, Eiichi N. Kodama, Aki Hori, Emil Salim,Takayuki Kuraishi, Naoya Hirata, Yasunari Kanda & Teigo Asai*. Synthetic biology based construction of biological activity-related library of fungal decalin-containing diterpenoid pyrones. Nat.Commun. (2020) 11:1830
文章链接：https://doi.org/10.1038/s41467-020-15664-4
【塔里木大学生命科学学院2018级硕士生牟鹏云，博士后朱梦奕】
