反相色谱法是以被测的高分子为固定相、以惰性气体为流动相，为了测定需要，在流动相中加入一些探针分子，它们是挥发性的低分子。

反相色谱法的作用

近十年来，高效液相色谱在蛋白质分离纯化方面取得了很大的进展，并得到了广泛的应用。HPLC包括排阻色谱、离子交换色谱、亲和色谱以及反相色谱等，几乎已在蛋白质分离中得到应用。这些方法在蛋白质分离中各有其地位，但到目前为止人们普遍认为反相高效液相色谱是分离纯化蛋白质的最有效的方法之一。

反相色谱法的影响因素

1、溶质的分子结构（极性）

极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。同系物碳数越多，极性越弱，k越大；引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。

2、固定相

键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质的k也增大。硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大。

3、流动相

极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大；溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂；溶剂比例：水的比例增加，使k增大。

化学慧定制合成事业部摘录