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茶叶香气成分的合成与逆境响应机制研究进展2018-10-31

代谢物的形成是植物在进化过程中作为一种环境反应发展来的一项生化和生理特性。这些代谢物不仅能够帮助植物抵御环境胁迫,而且能够提升作物品质。因此利用胁迫响应提升植物品质构成已受到越来越多的研究者关注。茶树是一种富含次生代谢物的植物,这些次生物质对提升茶的品质(比如茶汤颜色、风味、口感等)具有重要作用。茶中的次生代谢物质可以分为三大类别:酚类、氨基酸和香气成分(挥发物)。酚类和氨基酸影响着茶的口感,而且酚类还影响茶汤颜色。而香气成分则影响茶的风味。一般来说,酚类和氨基酸分别占茶总量的18%-36%和1%-4%,而香气成分仅占不到0.03%。目前利用气相色谱(GC)、气质联用色谱(GC-MS)、核磁共振(NMR)等技术手段从茶中已经鉴别和分离了700多种芳香组分。因为人类对不同香气组分的感受阈值存在差异,目前仅有少量香气组分可以确认提高了茶的风味。比如, 人类对类玫瑰香气成分(2-苯乙醇)水溶物的感受阈值在1000ug/L,而对类果香香气成分(大马烯酮)的感受阈值仅在4ng/L,这表明一些含量丰富的香气成分对茶风味的提升还不如一些含量低或者痕量的香气成分。

茶香气组分的合成是一个多样复杂的过程,根据不同的反应途径可分为三种类型。第一种为叶活细胞中的酶促反应(主要发生在茶叶收获前的生长和收获后部分的加工阶段,涉及茶香气相关基因的激活以及基质与酶之间的反应);第二种为叶细胞破坏后的酶促反应(主要发生在采收后的部分加工过程,涉及基质与酶之间的反应);第三种为热化学反应(主要发生在采收后的部分加工和深加工过程)。

本文将聚焦于前两种过程中的茶香气成分形成,对近年来茶叶中常见的几种香气组分(挥发性脂肪酸派生物、挥发性萜类、挥发性苯丙烷类/苯环类等)的形成研究进行小结。目前茶叶中一些关键的香气成分合成基因已得到分离鉴定和功能解析,而研究表明一些生物胁迫(如小绿叶蝉取食)和非生物胁迫(如光照、温度。机械损伤等)能够促进香气合成基因的表达进而引起茶叶中香气成分的提升,因此进一步明晰香气成分的合成与逆境响应机制之间的特殊关系,将有助于稳定、高效的改善茶叶品质。

1. 茶树中挥发物合成的直接研究

与其他植物中类似,茶树的挥发性物质根据代谢来源可以分为4大类:挥发性萜烯类(VTs)、挥发性苯丙烷类/苯环类(VPBs)、挥发性脂肪酸派生物(VFADs)和类胡萝卜素挥发性衍生物。这些挥发性物质在不同植物中的形成途径既有相同之处又各具特异。由于茶树的遗传转化体系还没有建立,目前直接研究茶叶中挥发性物质形成途径还具有难度,因此对茶叶中挥发性物质合成途径的研究大多基于其他植物的相关研究。下表和图2展示了近年来从茶树中分离克隆的香气组分合成酶类基因及它们的相关合成过程。

图2. 已知的参与茶叶香气成分形成的相关基因

目前对它们的功能研究大多仅为体外验证。 茶叶中具有自由挥发性化合物和糖基性结合挥发性化合物(GBVs),由于后者与它们的自由糖苷配体相比更易溶于水和反应更少,因此茶叶中的香气组分多以配糖体形式存在。许多GBVs,包括β-樱草糖苷酶和β-葡糖苷酶都能够被β-糖苷酶水解释放多种形式的挥发性香气物质,因此对茶叶中能够被β-糖苷酶水解的GBVs和合成的研究得到广泛关注。目前已经有1个β-樱草糖苷酶和3个β-葡糖苷酶从茶叶中得到分离鉴定,这些研究不仅揭示了它们的形成和代谢机制,也为控制茶叶香气品质提供了重要的分子工具。 除了糖苷水解途径之外,茶叶中许多香气成分是通过从头合成途径形成的。近年来,一些涉及这些从头合成途径最终步骤的关键酶类相关基因也已得到分离鉴定,比如参与芳樟醇、橙花叔醇、罗勒烯、水杨酸甲酯、吲哚、己烯醛等香气成分合成的相关基因。在一些情况下,有多种酶类参与同一终步反应形成香气物质,而由于同源基因的存在,多个基因也都能参与同一香气物质的形成。

2. 生物胁迫引起的香气物质形成

在正常条件下,植物中的大多数挥发物质都以液体形式存在。对于植物的营养组织而言,在环境胁迫下会合成和释放一些挥发性物质,这些胁迫诱导挥发物能够减少胁迫对植物的伤害。相比于非生物胁迫,对于生物胁迫引起的植物挥发物变化研究更为集中。对于茶树而言,在生长过程中同样会遭受植食性害虫侵害,这类害虫包括刺吸式的如茶小绿叶蝉和茶蚜、咀嚼式的如茶尺蠖、茶卷叶蛾和茶螨等,它们严重危害着茶叶的产量、外形和品质。在它们取食茶叶后,茶叶也会产生和释放多种挥发性物质包括VFADs、VPBs和VTs等。目前多数的研究集中在这些物质的生态功能上,而它们很可能也茶叶的香气组分,这其中最有名的例子就是乌龙名茶“东方美人”就是利用小绿叶蝉取食后的茶叶制作的,具有独特的熟果香和蜂蜜香。

这种香气是由挥发性的单萜构成,比如叶蝉侵害诱导产生的2,6-二甲基-3,7-辛二烯-2,6-二醇(diendiol I)和在乌龙茶制作过程中加热条件下由diendiol I派生出的脱氢芳樟醇。而有意思的是,机械损伤和遭受其他害虫侵害条件下并不产生diendiol I,这揭示出了小绿叶蝉侵害诱导香气物质形成的独特机制。 目前,尽管对于diendiol I在植物中的合成途径还不得而知,但是有一些研究表明它可能是由芳樟醇衍生出来的。叶蝉取食后能够诱导茶树CsLIS1 和 CsLIS2基因上调表达,大量释放芳樟醇,进一步研究发现连续损伤是叶蝉取食诱导茶树叶片释放芳樟醇的关键。此外,叶蝉取食除了诱导芳樟醇的大量释放,还能诱导香叶醇(牻牛儿醇)的大量释放,但是并不影响茶叶中香叶醇合酶的活性。而有趣的是,叶蝉的酶提取物中具有特殊的能催化牻牛儿醇二磷酸(GPP)产生香叶醇的物质,预示着叶蝉具有自身的香叶醇合酶,进而有助于茶叶形成和释放香叶醇。这也表明叶蝉取食后诱导茶叶产生和释放芳樟醇与香叶醇的机制是不同的,虽然二者的前体物质都是GPP。 因为diendiol I是叶蝉取食后特有的茶叶释放物质,因此可以作为叶蝉取食的标记物质。除此之外,植物激素尤其是茉莉酸,也是在植物遭遇植食性害虫诱导产生和释放的植物挥发物。在机械损伤和其他害虫取食后都能够诱导茉莉酸的释放,因此茉莉酸与diendiol I的产生是两个相对独立的信号途径。一般来说,植食性害虫取食后,植食性害虫派生诱导子(herbivore-derived elicitors)就会诱导植物产生和释放挥发物质,这些诱导子在不同植食性害虫中具有相对保守性,但是目前已知的诱导子并不能诱导diendiol I的释放,因此后续分离叶蝉这种独特的派生诱导子具有重要意义。

3. 非生物胁迫引起的香气物质形成

与生物胁迫相比,更多的非生物胁迫可以用于茶叶采摘前后茶叶香气调控,这些非生物胁迫包括土壤条件、光照、温度等,它们能够引起植物多种反应。这其中最重要的一个因子就属光照了,光照强度和波长变化都能够引起植物挥发物的变化,在实践应用中,黑暗处理(近乎无光)能够改善茶叶的风味品质。比如日本的玉露茶和抹茶在前期都要经过遮阴过程(3周左右),这样可以显著提高茶叶中多种香气物质的含量,尤其是VPBs。进一步研究发现遮阴能够加快转化为VPBs的上游代谢物的代谢,尤其是莽草酸、预苯酸、苯丙酮酸等。然而延长遮阴又会导致植株生殖生长加快,又减少了采摘生物量。因此还需要找出它们之间的平衡。目前,又有研究通过改变波长来探究茶叶香气物质的变化,结果发现与自然光或者黑暗处理相比,蓝光(470 nm) 和红光 (660 nm)能够显著提高采收前茶叶中包括VFADs、VPBs和 VTs在内的大多数挥发物质的产生,并能够诱导相关基因的表达,而对采收后的影响不大,此外与遮阴相比,蓝光或者红光处理在增加挥发物产生的同时还不影响生物量。光照对采收后茶叶香气物质产生影响较小可能与处理时间短有关,而其他非生物因素则对采收后的香气物质产生影响较大。一般来说,根据加工方式不同,茶可以分为6大类。如下图所示,其中乌龙茶在制作过程中受到的处理最多,而乌龙茶也是这6类茶中香气品质最明显的。

此外,乌龙茶制作过程中也是保持叶片活性时间最长的,因此可以认为乌龙茶香气品质独特得益于茶叶的胁迫应激生化反应。乌龙茶中最主要的香气成分是橙花叔醇和一些VFADs,它们在摇青阶段大量产生,并且相关基因的表达在摇青阶段也得到激活。另外除了机械损伤,干旱胁迫也能够芳香成分的产生。此外还有研究表明紫外照射采收后的茶青也能促进β-樱草糖苷酶和β-葡糖苷酶基因的表达,进而导致香气物质的释放。而茶叶的加工过程是伴随多种胁迫处理的,有研究发现采收后的低温处理也能够促进挥发物的释放,并且机械损伤和低温处理对于采收后茶叶中挥发物的释放具有协同效应。

4. 叶细胞损伤后的香气物质形成

无论是生物胁迫还是非生物胁迫下香气物质的形成都是发生在活细胞中,而当细胞损伤后同样存在酶反应产生香气物质。研究发现细胞损伤后叶片中RNA的含量急剧下降,这不能激活相关基因的表达而是终止了茶叶香气物质合酶基因的表达。但是在细胞损伤后却促进了位于不同细胞结构的基质与酶的交互作用,进而同样可以促进香气物质的产生。这其中研究最为透彻的例子当属配糖体结合香气物质在水解酶作用下释放自由香气成分的反应。茶叶中的配糖体结合香气物质大多是β型的,因此都能被相应的β-糖苷酶水解。茶树中目前只有一种β-樱草糖苷酶而有多种β-葡糖苷酶。目前已报道的3种β-葡糖苷酶分别属于GH1、GH3和 GH5家族成员(CsGH1BG1、CsGH3BG1 和 CsGH5BG1),它们都具有水解β-葡萄糖苷结合香气物质的功能,表明它们在功能上具有相似性,但是进一步发现它们却具有不同的亚细胞定位,其中CsGH1BG1和CsGH3BG1分别位于细胞质和液泡,而 CsGH5BG1位于细胞壁。

研究发现在乌龙茶加工过程中,从采摘到第一次摇青,茶叶的叶细胞还处于完整无损伤状态,不同的亚细胞间处于隔离状态;而在第二次摇青到第五次摇青过程中,细胞已经扭曲变大,而此时细胞壁仍然完好。这表明在这个过程中只有CsGH1BG1和CsGH3BG1参与水解反应释放香气物质,而由于β-樱草糖苷酶和CsGH5BG1都位于细胞壁,且β-樱草糖苷酶是最主要的糖苷结合香气组分,因此在这个过程中乌龙茶的香气组分并没有显著提升。而在红茶制作过程中,揉捻之后,β-樱草糖苷酶结合香气组分显著减少,表明此过程中发生了水解反应,预示着这是红茶香气物质形成的主要阶段。

5. 展望

综上所述,在茶叶采收之前,虫害及光波长是主要影响茶叶香气成分的因素,而采收之后,机械损伤和低温能够有效提高茶叶香气。因此利用胁迫响应机制能够稳定、高效提高茶叶香气。但是因为茶叶香气成分构成是多样复杂的,后续还有许多工作需要完善。首先对于茶叶香气组分合成的途径需要进一步研究,从基因水平,最好能够建立茶树的遗传转化体系,从体内实验为这些合成途径提供证据,可以从茶树原生质体的瞬时转化体系、农杆菌茶树毛状根浸染体系、花粉管通道等方法进行探索;从代谢水平,目前的研究多集中于组织水平,后续可考虑从细胞或者亚细胞水平,这将提供更精确的香气调控目标,最近矩阵辅助激光解吸/离子化成像质谱法和解吸电喷雾电离成像质谱法已成功应用于一些药用植物的代谢物的细胞水平分布定位研究;从上游信号水平,由于代谢物具有高度的环境胁迫敏感性,因此利用表观调控去研究或许也是一个选择。其次,采用基于胁迫反应的方法来改善茶叶的香气品质需要进一步合理的设计,平衡香气品质与产量及外观之间的关系就是首要考虑的问题,另外由于不同的虫害诱导产生的香气组分多种多样,如何在此基础上保证稳定的香气品质也是一个挑战。

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