高晓冬，教授，博士生导师。获得日本东京大学博士后，在日本和美国的高等科研院校从事教学、科研工作。曾先后担任美国纽约州立大学助理教授，日本北海道帝国大学副教授、博士生导师和日本国立产业综合研究所糖锁研究中心主任研究员。2011 年底赴任江南大学，现任江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室主任。
多年来从事细胞分子生物学和生物化学领域的研究工作，目前，团队主要研究课题如下：①真核细胞多萜醇寡糖生物合成途径糖基转移酶及其调控机制的分子生物学研究；②以真核细胞 N-糖基化途径为模板，利用固相寡糖酶合成等化学生物学方法，在体外实现定向构建人源化糖链（生物标记物）结构；③利用基因改造和调控等细胞生物工程技术，设计和构建细胞（酵母以及动物细胞）医药糖蛋白生产体系。同时，课题组还在独自研发稀有糖，以酵母孢子多寡糖为主的健康糖类产品的开发及其在食品、发酵和酶制剂等行业的产业化技术。
2002年国际稀有糖协会将稀有糖定义为自然界中存在但含量很低的单糖及其衍生物。据推测，自然界中大约有50种稀有糖，目前已发现34种。依据结构的不同，可分为丁醛糖、丁酮糖、戊醛糖、戊酮糖、己醛糖、己酮糖和七碳糖等。其中己酮糖又分为D-构型和L- 构型，D-构型包括D-塔格糖、D-山梨糖和D-阿洛酮糖等，L-构型包括L-塔格糖、L- 果糖、L- 山梨糖和1- 脱氧-L- 果糖等。
稀有己酮糖是近年来国际上研究功能性甜味剂的一个热点。高糖摄入引起的糖尿病、高血压和心血管疾病等，严重危害着人类的生命健康。蔗糖作为传统的食品甜味剂，以其甜味纯正、口感好等特点在食品工业中一直占据着举足轻重的地位。然而，蔗糖具有高能量、高血糖反应、糖尿病人不能食用等缺陷。稀有己酮糖具有低热量、天然甜味等优势，可作为功能性甜味剂；具备一定的生物活性，可清除自由基、保护神经及抗癌等 ；具有降血糖、降血压、减肥和改善肠道等功能，可用于糖尿病人辅助治疗；可作为前体合成一些具有生物活性的药物，同时还是各种糖苷酶的抑制剂。稀有己酮糖具有的独特的功能和潜在的医疗价值，对解决日益突出的公众健康问题具有非常重要的意义，因此在食品、医药、保健等方面具有广阔的应用前景。
然而，稀有糖在自然界中含量极少，大大制约其大规模应用。传统的化学合成虽然看似简单易行，实际上步骤繁琐，很难得到单一构型的产物，且副反应较多。相对于化学法，生物转化法具有反应条件温和、副产物少、纯化步骤简单、绿色环保等优点，逐渐成为稀有糖合成的主流方法。 日本香川大学Izumori教授创建的Izumoring方法可利用差向异构酶、醛糖异构酶和氧化还原酶等进行所有单糖及糖醇之间的相互转化来获得各种稀有糖。目前，稀有糖的生物法制备主要包括3方面内容：利用纯酶直接反应；利用固定化酶或全细胞进行转化；采用合成生物学的方法合成。
1 生物法合成稀有己酮糖
1.1 生物法合成D-塔格糖（D-tagatose）
近年来，生物法合成D-塔格糖的技术已经非常成熟。D-塔格糖是D-半乳糖的酮醛异构体，能够通过L-阿拉伯糖异构酶（AI）催化D-半乳糖合成；D-塔格糖是D-山梨糖的差向异构体，能够通过D-塔格糖差向异构酶（DTE）催化D-山梨糖合成；此外，D-塔格糖还能够通过半乳糖醇脱氢酶催化D-半乳糖醇合成。
Kim等在大肠杆菌中成功表达嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）来源的AI，并采用固定化酶技术催化500g/L 的D-半乳糖得到230g/L 的D-塔格糖。尽管D-塔格糖的产量很可观，但是D-塔格糖是美国FDA批准的一种食品添加剂，而应用于D-塔格糖合成的细菌均不是来源于GRAS（generally regarded as safe）食品级微生物，这可能存在隐患。因此，采用食品级微生物生产D-塔格糖成为了新的研究热点。Liu 等乳酸杆菌（Lactobacillus fermentum CGMCC2921） 来源的AI表达在食品级枯草芽孢杆菌的孢子表面，利用孢子固定化酶技术以100g/L 的D-半乳糖合成D-塔格糖，转化率达到75%。Guo等运用相同的技术将乳酸菌（Lactobacillus brevis PC16）来源的AI表达在枯草芽孢杆菌的孢子表面，利用枯草芽孢杆菌孢子催化125g/L 的D-半乳糖合成D-塔格糖，转化率达到79.7%。为了进一步降低生产成本，Xu等利用大肠杆菌表达AI偶联β-半乳糖苷酶（β-galactosidase），以乳糖为底物成功合成D-塔格糖，产量达到101g/L，转化率达到20.2%。
D-塔格糖是D-山梨糖的C3差向异构体，通过差向异构酶可相互转化。韩国学者Shin等发现海栖热袍菌（Thermotoga maritima）的TM0416基因编码的蛋白具有D-塔格糖差向异构酶的活性，不仅能催化D-山梨糖和D-塔格糖的相互转化，同时还能催化多种五碳糖和六碳糖的异构化反应。
D-塔格糖是D-果糖的C4差向异构体，D-果糖C4差向异构酶（DFE）可以转化D-果糖生成D-塔格糖，但实际上尚未发现此类酶的存在。Lee 等发现果糖1，6-二磷酸醛缩酶（FbaA）可以转化D-果糖-6-磷酸生成D-塔格糖-6-磷酸。因此，他们采用三酶串联策略生产D-塔格糖，经己糖激酶磷酸化D-果糖生成D-果糖-6-磷酸，经FbaA转化生成D-塔格糖-6-磷酸，经植酸酶脱去磷酸基团得到D-塔格糖，转化率高达96.3%。
半乳糖醇是一种六元醇，可通过醛糖还原酶催化半乳糖制得。因此，通过氧化D-半乳糖醇可制得D-塔格糖。Sha 等采用计算机辅助筛选策略， 筛选出一种来源于脱氮副球菌（Paracoccus denitrificans）的多元醇脱氢酶（PDH），并与嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）来源的NADH氧化酶（NOX）偶联，实现NAD+的再生，连续反应15h，D-塔格糖的转化率达到91%。
1.2 生物法合成D-山梨糖（D-sorbose）
D-山梨糖和D-塔格糖是C3差向异构体，可通过差向异构酶相互转化。因此，可通过DTE催化D-塔格糖变构生成D-山梨糖。Yoshida等发现假单胞菌（Pseudomonas cichorii）来源的DTE具有广泛的底物催化活性，不仅能够转化D- 塔格糖生成D-山梨糖，还可以转化D-果糖生成D-阿洛酮糖，以及催化脱氧酮糖之间的转化。Uechi等发现百脉根瘤菌（Mesorhizobium loti）来源的L-核酮糖-3-差向异构酶（LRE）不仅可以催化L-核酮糖转化为L-木酮糖，还可以催化D-塔格糖生成D-山梨糖。Park等发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）来源的核糖-5-磷酸异构酶（RpiB）也具有广泛的底物特异性，如对L-来苏糖、L-甘露糖、L-果糖、D-山梨糖、D-阿洛酮糖等具有催化活性，其中催化D-古洛糖生成D-山梨糖，转化率达到90%。Khan等采用两步法合成D-山梨糖（图1）：半乳糖醇脱氢酶氧化半乳糖醇生成D-塔格糖，再经过C3差向异构酶生成D-山梨糖；或者直接通过C2脱氢酶作用，如L-葡萄糖醇直接脱氢生成D-山梨糖，同时L-葡萄糖醇可通过化学法还原低价值的D-古洛糖酸-1,4-内酯制得。
图1 通过半乳糖醇和L- 葡萄糖醇合成D-山梨糖
前期研究发现大肠杆菌来源的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶（RhaD）能够催化磷酸二羟基丙酮（DHAP）和D-甘油醛（D-GA）发生羟醛缩合反应，经过酸性磷酸酶（AP）脱去磷酸基团生成两种稀有糖D-山梨糖和D-阿洛酮糖。并且，这两种非对映体异构体能够通过Ca2+交换树脂分离。由于DHAP价格昂贵且不稳定，为了避免直接使用DHAP，可通过甘油磷酸氧化酶（GPO）氧化L-3-磷酸甘油制备。因此，笔者研究团队以更为便宜的DL-3-磷酸甘油（DL-GP）为底物，D-GA为受体，采用“一釜四酶法”成功合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖，D-山梨糖与D-阿洛酮糖的比例为1∶1，分离纯化后总产率为39%（图2）。
图2 “一釜四酶法”合成D- 山梨糖和D- 阿洛酮糖
为了进一步降低成本，笔者 研究团队在大肠杆菌中共表达醛缩酶（RhaD）和磷酸酶（YqaB），以甘油为底物，分批加入D-GA，连续发酵15h，D-山梨糖和D-阿洛酮糖的产量分别为1.6g/L 和1.23g/L，产率为79%。同时， 研究团队也尝试以葡萄糖为底物，以D-GA为受体，连续发酵20h经纯化后得到D-山梨糖和D-阿洛酮糖， 分离纯化后总产率为21%。Yang 等在谷氨酸棒状杆菌中共表达RhaD和YqaB，以葡萄糖为底物，D-GA为受体，成功合成了D-山梨糖和D-阿洛酮糖；敲除磷酸甘油醛异构酶（TPI）基因后，DHAP积累量提高20倍；分批次加入D-GA，连续发酵26h，最终D-山梨糖和D-阿洛酮糖的产量分别为19.5g/L 和13.4 g/L，产率为56%。
1.3 生物法合成D- 阿洛酮糖（D-psicose）
D-阿洛酮糖是D-果糖的C3差向异构体，可通过差向异构酶相互转化制得，如DTE可催化D-果糖的C3位置差向异构生成D-阿洛酮糖。Patel等采用根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） 来源的DTE催化700g/L的D-果糖， 反应30min得到178g/L 的D-阿洛酮糖。Song等利用根瘤农杆菌来源的DTE催化水解后的蔬菜残渣生产D-阿洛酮糖，转化率高达86.2%。Bo sshart等采用酶膜反应器（EMR） 技术利用假单胞菌（Pseudomonas cichorii）来源的DTE转化D-果糖生产D-阿洛酮糖，生产效率达到10.6kg/（L·d）。随着研究的深入，如海栖热袍菌（Thermotoga maritima）、球形红菌（Rhodobacter sphaeroides SK011）、梭状芽孢杆菌H10（Clostridium cellulolyticum H10）以及梭状芽孢杆菌35704（Clostridium scindens35704）等来源的DTE相继被发现。
笔者研究团队利用嗜热链球菌HB8（Thermus thermophilus HB8）来源的L- 墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶（FucA）采用“一釜四酶法”特异性地合成D-阿洛酮糖，除了生成主要产物D-阿洛酮糖外，还有少量的D-山梨糖生成，D-阿洛酮糖与D-山梨糖的比例为8:1，分离纯化后总产率为58%。
1.4 生物法合成 L-塔格糖（L-tagatose）
L-塔格糖是D-塔格糖的对映异构体，由于其合成受限，价值昂贵，尚未得到深入的研究和广泛的应用。L-塔格糖可通过差向异构酶和氧化还原酶等催化合成。L-山梨糖和L-塔格糖是C3差向异构体，因此，用DTE转化L-山梨糖可进行制备，也可通过半乳糖醇脱氢酶氧化半乳糖醇进行合成，或者经C2氧化L-塔洛糖醇制得。Bosshart等采用EMR技术利用假单胞菌（Pseudomonas cichorii）来源的DTE转化L-山梨糖生产L-塔格糖，生产效率达到478g/（L·d）。Park 等发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）来源的RpiB能够催化L-塔洛糖生成L-塔格糖，转化率达到90%。
笔者研究团队采用Thermus thermophilus HB8来源的FucA，以DL-3-磷酸甘油为底物采用“一釜四酶法”合成L-塔格糖。当以L-甘油醛（L-GA）为受体时，可同时获得两种稀有己酮糖L-塔格糖和L-果糖，两者可通过Ca2+交换树脂进行分离纯化，纯化后总产率为47%。Yang等采用“一釜三酶法”以DHAP为底物，加入L-GA，在D-1, 6- 二磷酸果糖醛缩酶（FruA）和D-1, 6-二磷酸塔格糖醛缩酶（TagA）作用下经YqaB脱去磷酸基团合成L-山梨糖和L-塔格糖；在此基础上，利用代谢工程技术改造谷氨酸棒状杆菌，以葡萄糖为底物，L-GA为受体，成功合成L-山梨糖和L-塔格糖，产量分别为1.30g/L和1.23g/L，产率为25%。
1.5 生物法合成L- 果糖（L-fructose）
L-果糖是L-甘露糖的酮醛异构体，能够通过AI 催化L-甘露糖合成；L-果糖是L-阿洛酮糖的差向异构体，能够通过DTE催化L-阿洛酮糖合成；此外还可以通过多元醇脱氢酶催化L-甘露糖醇合成L-果糖。
Park 等发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）来源的RpiB催化L-塔洛糖生成L-塔格糖，转化率达到80%。Itoh 等发现DTE催化L-阿洛酮糖合成L-果糖，转化率达到65%。Dhawale等从细菌（代码MD-13）中发现一种多元醇脱氢酶，可氧化L-甘露糖醇生成L-果糖。由于转化效率低、成本高，这些方法尚未得到广泛应用。
L-果糖可以通过RhaD催化DHAP和L-GA发生羟醛缩合反应后经AP脱去磷酸基团而制得。Sugiyama 等发现在硼酸盐缓冲液中RhaD可以利用DHA代替DHAP与L-GA发生羟醛缩合反应，直接得到L-果糖，而且转化率高达92%。笔者研究团队利用RhaD醛缩酶采用“一釜四酶法”，以DL-3-磷酸甘油为底物，以L-GA为受体，仅生成一种稀有糖L- 果糖，分离纯化后的产率为66%。
尽管以上方法可行性高、成本相对低廉，但是距离工业化应用还有一段距离。Yang等提出一个非常有前途的方案，以甘油为底物，无需添加L-GA受体合成L-果糖。一方面，甘油转运蛋白（GlpF）运输甘油进入细胞内，经甘油激酶（GK）磷酸化生成甘油3-磷酸后，再经甘油3-磷酸脱氢酶（GlpD）氧化生成DHAP ；或者经甘油脱氢酶（DhaD）氧化生成DHA，后经二羟基丙酮激酶（DhaK）磷酸化生成DHAP。另一方面，甘油在马肝乙醇脱氢酶（HLADH）作用下氧化生成L-GA。两个支路分别合成DHAP和L-GA，在RhaD催化作用下合成L-果糖（图3）。通过敲除TPI基因，积累更多的DHAP，同时敲除锌离子依赖型乙醇脱氢酶基因Cgl0331，减少L-GA的消耗，并对发酵条件进行优化，最终L- 果糖的产量达到20.8g/L。
图3 谷氨酸棒状杆菌利用甘油合成L-果糖
1.6 生物法合成L- 山梨糖（L-sorbose）
Kim等采用大肠杆菌表达氧化葡萄糖杆菌G624（Gluconobacter oxydans G624）来源的山梨醇脱氢酶（SLDH），应用固定化酶技术成功转化D-山梨醇生成L-山梨糖，转化率为62.8%。Wang 等通过固定化氧化葡萄糖杆菌WSH-003（Gluconobacter oxydans WSH-003）全细胞技术催化合成L-山梨糖，转化率达到81.0%。
笔者研究团队采用“一釜四酶法”，以DL-3-磷酸甘油为底物，FruA 以L-GA为受体，只生成一种稀有糖L- 山梨糖，纯化后产率为28%。Yang等采用谷氨酸棒状杆菌以甘油为底物，敲除基因cgl0331同时过表达GlpF、DhaD、DhaD、HLADH、FruA及YqaB等6个蛋白，成功合成L-山梨糖，产量为1.2g/L。但是，产量距离工业化应用仍有很大差距，需进一步提高。
1.7 生物法合成1- 脱氧-L-果糖（1-deoxy-L-fructose）及其他脱氧己酮糖
1-脱氧-L-果糖也是一种稀有己酮糖，目前报道的合成方法相对较少。Gullapalli等建立了一个有效的合成方法（图4）。L-鼠李糖（又名6- 脱氧-L-甘露糖）通过化学加氢作用生成L-鼠李糖醇（又名6-脱氧-L- 甘露醇），可被产气肠杆菌IK7（Enterobacter aerogenes IK7）氧化生成1- 脱氧-L-果糖，转化率为65%。
图4 化学酶法合成1-脱氧-L-果糖
Izumori教授创建的Izumoring方法同样适用于脱氧己酮糖的相互转化，这项技术依赖于DTE具有催化酮糖碳3位相互转化的能力。1-脱氧-L-果糖在DTE催化下生成1-脱氧-L-阿洛酮糖，转化率为75% ；经化学加氢及产气肠杆菌IK7催化生成6- 脱氧-L-塔格糖或6-脱氧-D-阿洛酮糖，6-脱氧-D-阿洛酮糖在DTE催化下又生成6-脱氧-D-果糖，转化率为50%。以L-鼠李糖为底物，可通过化学酶法合成10 种不同的稀有脱氧酮糖：1- 脱氧-L- 果糖、1- 脱氧-L-阿洛酮糖、6-脱氧-L-塔格糖、6-脱氧-D-阿洛酮糖、6-脱氧-D-果糖、6-脱氧-L-果糖、6-脱氧-L-阿洛酮糖、1-脱氧-L-塔格糖、1-脱氧-D-阿洛酮糖和1- 脱氧-D-果糖。
2 稀有己酮糖合成策略的研究趋势
稀有己酮糖生物合成技术的发展，尚处于研究阶段，距离工业化生产及应用还有差距。当前用于稀有糖合成的酶类主要包括醛糖酮糖异构酶、差向异构酶和氧化还原酶，但这3种酶类在实际应用中均有不足。①醛糖酮糖异构酶的专一性不够高，易产生副产物，不利于产物的后期纯化。②差向异构酶催化是可逆反应，不适合大规模生成，如何控制反应的正向进行是个亟待解决的问题。③氧化还原酶通常需要NAD+、NAD（P）H等辅酶因子参与，生产成本高。总体来说，大多数稀有己酮糖的合成路线仍然很有限，且合成成本高，产率比较低，这也导致稀有己酮糖的价格很高。目前，应用于稀有己酮糖合成的细菌大多不是来源于GRAS微生物，因而构建一种高效、低成本、安全的可大量制备稀有糖的合成平台显得极其重要。
C—C键的不对称合成一直被认为是有机合成领域最具有挑战性的课题之一。醛缩酶催化的羟醛缩合反应已经成为C—C键不对称合成必不可少的工具之一。在醛缩酶家族中，DHAP依赖型醛缩酶应用最为广泛，常被用来合成许多常规化学法难以合成的糖类化合物。这种醛缩酶共有4种类型，分别为RhaD、FucA、FruA和TagA。这4种醛缩酶催化的不对称羟醛缩合反应的立体化学是两两互补的，理论上以DHAP为供体，同一醛分子作为受体可以得到一整套邻二醇的非对映异构体，这些特性使得DHAP依赖型醛缩酶非常适合于各种稀有己酮糖的合成。
因此，利用DHAP依赖型醛缩酶在GRAS微生物中建立具有潜在的大规模合成稀有己酮糖能力的平台最有前途。以葡萄糖或者价格低廉的工业副产物甘油作为“绿色”碳源，利用糖酵解途径或者人工构建的甘油代谢途径在胞内产生并积累DHAP，同时基于甘油脱氢酶、乙醇脱氢酶、糖醇脱氢酶或多元醇脱氢酶氧化甘油合成L-GA或D-GA或3-羟基丙醛（3-HP）， 分别在RhaD、FucA、FruA和TagA这4 种DHAP依赖型醛缩酶作用下，合成一系列D-构型或L-构型的己酮糖。如Yang等采用HLADH氧化甘油合成L-GA，分别在4 种DHAP依赖型醛缩酶作用下，合成L-果糖、L-塔格糖、L-山梨糖和L-阿洛酮糖等，其产量分别为20.8g/L、10.3g/L，1.2g/L和0.95g/L。以上采用甘油为底物，大大降低了生产成本；但是HLADH活性较低，使得L-系列的己酮糖的产量较低。因此，探究高效的甘油脱氢酶或者甘油氧化酶至关重要。随着生物技术的发展，通过基因改造提高酶活力，或者通过计算机模拟筛选高效新酶已经得到广泛应用。如对HLADH进行突变或者运用计算机技术筛选替代HLADH的高活性新酶将是未来合成L-构型稀有己酮糖的新动向；探究能够合成D-GA的甘油脱氢酶或氧化酶，将是未来合成D-构型稀有己酮糖研究的新方向；挖掘高效的甘油脱氢酶、乙醇脱氢酶、糖醇脱氢酶或多元醇脱氢酶等合成3-HP，也将是未来合成脱氧己酮糖的新热点。
然而，醛缩酶催化DHAP和醛受体时，往往失去了对该醛受体的立体选择性。如RhaD和FucA以D-GA为受体时同时产生D-阿洛酮糖和D-山梨糖，FucA以L-GA为受体时同时产生L-果糖和L-塔格糖。由于己酮糖理化性质几乎完全相同，很难精制和提纯，但为了工业化应用，就必须解决这一难题。利用基因工程手段结合计算机模拟蛋白质-小分子晶体结构技术，理性改造醛缩酶，对其立体选择性进行优化使其专一性地生产单一己酮糖，这对于解决稀有糖同分异构体的分离纯化问题具有重要意义。笔者研究团队采用计算机模拟对底物分子与酶分子进行对接，分析系统能量最小化时，底物与酶分子发生相互作用的关键氨基酸。通过对RhaD醛缩酶的理性改造，已初见成效。大肠杆菌来源的RhaD醛缩酶的第152位酪氨酸的定点饱和突变能够显著影响该酶的立体选择性。其中RhaDY152A突变体倾向于生成D-阿洛酮糖，D-阿洛酮糖和D-山梨糖的比例从最初的1∶1显著提高到8∶1 ；RhaDY152N突变体倾向于生成D-山梨糖，D-阿洛酮糖和D-山梨糖的比例从最初的1∶1显著提高到1∶10。通过对酶分子的理性改造，笔者研究团队已经找到能专一性合成高附加值D-阿洛酮糖的RhaD醛缩酶突变体。而这一设想的提出，对今后更多DHAP依赖II型醛缩酶的立体选择性研究提供了理论依据和方法，同时也让我们看到了稀有糖的工业化生产的希望。
全文刊登于《生物产业技术》2018年第6期
