β-羟基-α-氨基酸是一类重要的手性砌块，通过对官能团的进一步修饰，能够合成多种手性药物。苏氨酸醛缩酶催化醛和甘氨酸羟醛加成反应，可以一步合成β-羟基-α-氨基酸，具有环境友好，反应条件温和等优点。酶促催化羟醛加成反应引入C-C键形成两个手性中心，最明显的应用瓶颈是β-位的立体选择性不高，导致生成的是异构体混合物。为了解决该酶催化反应的立体选择性控制问题，中国科学院天津工业生物技术研究所的朱敦明和吴洽庆研究团队开发了一种新颖的苏氨酸醛缩酶催化活性和β-碳立体选择性筛选方法。基于与底物官能团（氨基、羟基）相互作用的组合突变方式，利用开发的筛选方法，获得了β-碳的立体选择性提高或者翻转的有益突变体。

产物β-羟基-α-氨基酸具有两个手性中心，在D-或L-苏氨酸醛缩酶催化下生成非对映异构体，采用HPLC等方式分析产物的立体选择性难以适用于大规模的筛选。天津工业生物技术研究所团队设计并建立了偶联立体选择性的脱水酶，针对苏氨酸醛缩酶的合成活性和立体选择性的可视化筛选方法（图1）。偶联脱水反应特异性地分解羟醛加成中的一种构型产物生成相应的酮酸，分别以醛和酮酸作为检测化合物，建立了Purpald和Fe³⁺比色法。消耗的醛和生成的酮酸分别衡量L-threo/erythro-β-羟基-α-氨基酸和L-threo-β-羟基-α-氨基酸，进而测定突变体的催化活性和立体选择性。筛选方法应用于整细胞转化，结果表明可视化方法与HPLC检测结果基本一致。

图1 偶联立体选择性脱水酶的筛选方法原理

基于建立的筛选方法，对酶分子进行定向进化。首先选择活性中心的10个位点（图2A绿红色部分），又扩充了18个位点（图2A中红色部分）进行点饱和突变，都没有获得有益突变体。对活性中心的10个位点按照CASTing方式组合突变，依旧没有获得有益突变体。我们推测底物的识别和产物的特异性受到活性中心微环境影响，基于同时绑定底物官能团中羧基、羟基、氨基或苯基的考虑，同时突变不同的两个位点来绑定官能团中的两个（图2B）。突变的位点在空间上是相近的，可提高氨基酸残基的协同效应，重塑酶活性中心。

图2 点饱和突变和CASTing位点的选择(A)；基于与底物官能团相互作用的位点的选择(B)

组合突变库的筛选获得了有益突变体，在较高转化率的情况下，D93H/E147D对邻位卤代苯甲醛的de值达到70%左右，目前报道的所有底物中de值最高的。更有意义的是，D93N/E147D催化产物的构型产生了反转，即生成的产物更加偏好erythro构型，这是目前首次报道分子改造实现苏氨酸醛缩酶催化产物构型的反转。通过分子模拟阐释了立体选择性变化的机理。

这一成果近期发表在ACS Catalysis 上，文章第一作者是中国科学院天津工业生物技术研究所博士研究生陈启佳。该研究得到了国家自然科学基金(No.21602246)，中科院STS项目(KFJ-SW-STS-164)和天津市科学技术委员会(15PTGCCX00060和15PTCYSY00020)的支持。