肠道菌群是人体肠道内的正常微生物，中药在进入机体之后，与肠道微生物菌群发生接触而被代谢，另外一些经肝脏代谢的产物还会通过胆汁的分泌而进入肠道参与肠道菌群代谢，因此研究肠道菌群对药物代谢与药物药效发挥过程的影响具有重大意义[1]。石榴皮为石榴科植物石榴Punica granatum L. 的干燥果皮，富含丰富的鞣质，是其药效物质基础，石榴皮中的总鞣质具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抑精、改善慢性肾功能等作用。本研究考察肠道菌群对石榴皮总鞣质的分解代谢作用，以阐明石榴皮鞣质在肠道内的代谢途径[2]。
1 材料
1.1 药材与试剂
石榴皮购于武汉市中药材市场，经武汉大学人民医院药品供应管理科张洪教授鉴定为Punicagranatum L. 的干燥果皮，质量合格且符合《中国药典》2015年版标准。没食子酸（批号20150912，质量分数＞99%，成都曼斯特生物科技有限公司）；HPD树脂（天津宝恩化工科技有限公司）；GAM肉汤培养基（青岛海博生物有限公司）；磷钼钨酸（国药集团化学试剂有限公司）；其他实验试剂均达到实验分析化学用标准。
1.2 仪器
液相色谱三重四级杆-质谱（LC-MS/MS）联用仪（赛默飞世尔科技公司）；台式高速冷冻离心机（郑州南北仪器设备有限公司）；RE-52C旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；ALPHAI-4/RZ-2型冷冻干燥机（德国Martin Christ公司）；厌氧培养箱（广州三元科技有限公司）；FZ10粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；UV-1800紫外可见分光光度计（Shimadzu Corporation公司）。
1.3 实验动物
雌性SD大鼠，体质量180～220 g，8只，购于湖北省疾控中心动物所。实验动物许可证号SCXK（鄂）2008-0005；动物质量合格证号420004000031246。大鼠置于武汉大学第一临床学院动物实验中心SPF级大鼠饲养房中，适应喂养1周后正式开始实验。
2 方法
2.1 药物的提取与测定
2.1.1 药材的提取 取一定量的干燥石榴皮，经FZ10粉碎机进行充分粉碎后，与70%丙酮有机溶剂按照1∶10常温避光浸渍6 h，超声辅助提取30 min，上述操作重复进行2次，合并收集滤液，减压浓缩至小体积除去丙酮，冷冻干燥得石榴皮鞣质粗提物。
2.1.2 粗提物的纯化及总鞣质的定量测定 参照本课题组前期确定的纯化分离方法[1]，即采用HPD-400大孔树脂进行纯化，配制4.36 mg/mL的石榴皮粗提物溶液进行装柱，装柱量为5 BV，调整吸附体积流量为2 BV/h，使用70%乙醇进行洗脱。收集洗脱液，用旋转蒸发仪进行浓缩，冷冻干燥，即可得石榴皮鞣质粉末，将纯化得到的石榴皮干燥粉末密封置于干燥器中为后续实验备用。参照《中国药典》2015年版制定的鞣质测定方法磷钼钨酸-干酪素比色法进行石榴皮鞣质总量的测定[2]。最终测得终产品的总鞣质质量分数为60.49%。
2.2 培养基的制备
取10.0 g蛋白胨、10.0 g朊蛋白胨、3.0 g大豆胨、5.0 g酵母浸粉、13.5 g消化血清、1.2 g牛肝浸出粉、2.2 g牛肉膏、3.0 g葡萄糖、3.0 g氯化钠、2.5 g磷酸二氢钾、5.0 g可溶性淀粉、0.3 g硫代乙酸钠、0.3 g L-半胱氨酸盐酸盐、16.0 g琼脂粉（1.6%），加1 000 mL蒸馏水。按照上述组成配制培养基，调节pH值至7.0左右。
2.3 培养基的分装及灭菌
将“2.2”项下肉汤培养基按照一定比例进行加热配制，配制结束后将其分装至500、250、100 mL的量瓶中，加胶塞，并用锡纸包裹对瓶口进行密封，放入高压灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为15 MPa，121 ℃，灭菌20 min。待自然冷却后取出待用[3]。
2.4 大鼠肠道菌群培养液的制备
取大鼠新鲜粪便4.0 g，按1∶4（g/mL）将新鲜粪便与生理盐水混合配制成粪悬浊液，置于高速离心机中离心20 min（3 500r/min），上清液即为大鼠肠道菌液。取0.5 mL的肠道菌液，加至4.5 mL的厌氧培养液中（已灭菌），混匀振荡，于37 ℃厌氧条件下培养24 h，即得大鼠肠道混合菌群储备液[4]。
2.5 大鼠肠道菌群的活化
将大鼠肠道菌群储备液与已配制好的厌氧培养基按照1∶9进行混合，用玻璃棒充分搅拌，精密加入0.201 mg/mL的石榴皮鞣质甲醇溶液10 μL，涡旋30 s，混匀后制备得大鼠肠道菌群培养液。将大鼠肠道菌群孵育液置于培养瓶中，按时间点分为6组，每组6 mL，于37 ℃、CO2恒温培养箱厌氧环境中分别培养4、6、8、12、24、48 h。同时移取大鼠肠道菌群储备液6 mL置于9 mL的培养瓶中作为对照。培育时间结束后，取出培育液，于冰水浴中停止反应。加入异丙醇200 μL、醋酸乙酯4.0 mL，旋涡3 min，于3 000 r/min离心10 min，弃掉下层沉淀，将上层清液转移至5 mL EP管中，于40 ℃条件下用N2吹干，加入100 μL乙腈，旋涡60 s，12 000 r/min离心5 min，吸取上清液过0.45 μm滤膜滤过，进行LC-MS/MS分析[5]。
2.6 LC-MS分析条件
2.6.1 色谱条件 PHENOMEX QC MIX870色谱柱（50 mm×4.6 mm，2.6 μm），进样量1 μL，柱温40 ℃，运行40 min。色谱纯乙腈为流动相A，0.1%甲酸-水为流动相B，体积流量为2 mL/min。梯度洗脱条件为0～5 min，0～20% A；5～12 min，20%～50% A；12～25 min，50%～80% A；25～30 min，80%～85% A；30～35 min，85%～90% A；35～40 min，90%～100% A；梯度洗脱完后继续运行5min。检测波长305 nm。
2.6.2 质谱条件 采用负离子扫描模式进行多级质谱全扫描，质量扫描范围m/z 100～1 500，离子源喷射电压4 kV，毛细管电压为4 kV；雾化器压力为275.79 kPa；干燥气体积流量为10 L/min，干燥气温度为350 ℃。
3 结果
3.1 肠道菌群培养
石榴皮鞣质肠道菌群经过37 ℃、CO2恒温培养箱厌氧环境中的培育后，可以明显看到大鼠肠道菌群微生物的繁殖和生长，导致孵育培养液变浑浊，且多数沉淀聚集在培养瓶底端，与厌氧微生物生长代谢规律接近。另外实验中还发现随着培育时间的不断增长，培养品中的培养液浑浊程度越明显，颜色越深，代谢积累沉淀越多[6-7]。
3.2 HPLC-MS分析结果
3.2.1 石榴皮鞣质类成分不同转化时间点总离子流图 采用LC-MS/MS技术对6组石榴皮鞣质肠道菌群孵育样品和对照样品进行检测分析，得石榴皮鞣质类成分不同转化时间点总离子流图（图1）。一般情况下，与对照组比较，新出现的峰或同一保留时间下峰强增加的峰可能为代谢产物。本课题组前期已经通过实验证实了石榴皮鞣质中主要单体成分为安石榴苷、鞣花酸、没食子酸、安石榴林等富含酚羟基的化合物，根据这些单体化合物的母核结构信息及药物在代谢酶作用下的代谢转化规律，预测石榴皮鞣质在肠道菌群作用下的代谢产物，将这些目标代谢产物的一级质谱信息质荷比通过LC-MS/MS自带的提取离子流色谱功能进行定位，如果一级质谱信息匹对成功，将其离子碎片敲碎继续做二级质谱，结合二级质谱信息与目标代谢物的裂解规律确定其最终产物[8]。
3.2.2 代谢产物的初步鉴定 本实验一共初步鉴定出10种石榴皮鞣质大鼠肠道菌群代谢化合物，化合物信息见表1。
代谢产物M1，分子离子峰m/z 211.100 [M－H]−（tR＝4.39min），二级质谱碎片m/z167.100 [M－H－COO]−，通过与文献报道[9]的代谢产物尿石素B的二级质谱碎片信息进行匹配，发现结果一致，最终进一步证实石榴皮鞣质肠道菌群代谢产物M1为尿石素B。代谢产物M1的二级质谱信息和结构式及可能的裂解方式见图2。
代谢产物M2的分子离子峰m/z169.120 [M－H]−（tR＝5.21 min），通过与预测的目标化合物没食子酸的一级相对分子质量169.014对比，匹配误差较小，因此初步判断M2为没食子酸[10]。
代谢产物M3，分子离子峰 m/z 125.025 [M－H]−（tR＝10.08 min），二级质谱碎片离子为m/z 81.034 [M－CO－OH]−，通过与文献报道[11]中的代谢成分焦性没食子酸的二级质谱碎片信息匹配，结果一致，证实代谢产物M3为焦性没食子酸。代谢产物M3的二级质谱信息和结构式及可能的裂解方式见图3。
代谢产物M4的分子离子峰m/z 183.030 5[M－H]−（tR＝20.01 min），而MS2有2个碎片离子，分别为 m/z168.011 [M－CH3]−的离子碎片和m/z123.960[M－COO]−的碎片离子，因此推测其为3-O-甲基没食子酸[12]。
代谢产物M5，分子离子峰 m/z227.104 [M－H]−（tR＝22.34min），二级质谱碎片m/z199.039 [M－CO－H]−，通过与目前文献中所报道的代谢产物尿石素A的二级质谱碎片信息匹配，结果一致，证实石榴皮鞣质肠道菌群代谢产物M5为尿石素A[13]。代谢产物M5的二级质谱信息和结构式及可能的裂解方式见图4。
代谢产物M6，分子离子峰 m/z 241.050 [M－H]−（tR＝26.67min），二级质谱碎片m/z210.904 [M－OCH3]−和m/z 196.986 [M－COO]−，通过对文献报道[14]中的代谢产物甲基化尿石素A二级质谱碎片信息匹配，结果一致，证实石榴皮鞣质肠道菌群代谢产物M6为甲基化尿石素A。代谢产物M6的二级质谱信息和结构式及可能的裂解方式见图5。
代谢产物M7，分子离子峰 m/z 243.200 [M－H]−（tR＝27.02min），二级质谱碎片离子m/z215.199 [M－CO]−，通过与目前文献报道[15-17]的代谢产物尿石素C的二级质谱碎片信息匹配，结果一致，最终进一步证实石榴皮鞣质肠道菌群代谢产物M7为尿石素C。代谢产物M7的二级质谱信息和结构式及可能的裂解方式见图6。
代谢产物M8的分子离子峰 m/z 259.020 [M－H]−（tR＝27.46 min），通过与预测的目标代谢化合物一级相对分子质量260.200比对，误差小于0.5%，推断代谢产物M8为尿石素M6[18]。代谢产物M9、M10二级质谱均有176碎片丢失，证明为结合葡萄糖醛酸化的II相代谢产物。
代谢产物M9的分子离子峰 m/z 403.3 [M－H]−（tR＝28.11 min），二级质谱丢失176得到碎片m/z227.100，结合先前已知的代谢产物的结构分析，最终鉴定M9为葡萄糖醛酸化尿石素A[19]。
代谢产物M10的分子离子峰m/z 418.300[M－H]−（tR＝31.685 min），二级质谱丢失176 得到碎片m/z243.030，结合文献报道[20]和代谢物匹配分析，推测M10为葡萄糖醛酸化尿石素C。
4 讨论
机体肠道中生存着大量的活体微生物，其中90%以上为厌氧型细菌。由于肠道菌群中存在着多种不同种类的细菌，所包含的药物代谢酶也各有不同，决定了药物肠道菌群发生代谢转化具有多样性等特点[21]。肠道菌群代谢主要涉及的生化反应类型为水解和还原反应，目前研究已经证实许多中药有效成分在机体肠道菌群代谢转化后能形成一些高生物活性的代谢产物[22]。因此，研究中药肠道菌群体外代谢对于药物活性成分的转化与作用机制的探讨具有重要意义。
本实验重点研究了石榴皮鞣质在大鼠肠道菌群中的代谢产物，研究结果显示，将肠道菌群与石榴皮鞣质孵育，经HPLC-MS技术检测，共鉴定出10个代谢产物，分别为尿石素B、没食子酸、焦性没食子酸、3-O-甲基没食子酸、M5尿石素A（Urolithin A）、甲基化尿石素A、尿石素C、尿石素-M6、葡萄糖醛酸化尿石素A、葡萄糖醛酸化尿石素C。石榴皮鞣质类成分经大鼠肠道菌群代谢后，没食子酸类鞣质通过水解作用主要产生焦性没食子酸、3-O-甲基没食子酸；鞣花鞣质类鞣质在培养液中经水解首先形成鞣花酸，然后再经肠道菌群代谢酶的转化作用形成一系列分子量小、极性低的尿石素类化合物，再与葡糖糖醛酸等大分子物质进行II相结合反应，生成葡萄糖醛酸化尿石素系列物，其可能的代谢途径见图7。推测石榴皮鞣质在肠道菌群中主要通过
代谢酶的水解、还原等作用将其代谢成具有生理活性的小分子化合物，这些化合物有可能是石榴皮鞣质在机体内发挥药理活性的物质基础[23]。但目前关于代谢产物的药理活性研究报道较少，后面会继续开展有关这些代谢产物的药理活性与转化调控的系列研究。
参考文献（略）
来 源：陈 鹏，涂晶晶，李巧玲，周本宏. 肠道菌群对石榴皮鞣质的分解代谢作用研究 [J]. 中草药, 2019, 50(14):3396-3402.
