胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，据文献报道，中国脑胶质瘤年发病率为3～6人/10万人，年死亡人数达3万人。胶质瘤为浸润性生长，和正常脑组织没有明显界限，难以完全切除，对放疗、化疗不甚敏感，非常容易复发，至今仍是全身肿瘤中预后最差的肿瘤之一。将抗肿瘤药物与引经药联合使用，增加治疗药物靶区的浓度，是提高脑胶质瘤治疗效果的有效手段。王南卜等[1-2]发现β-细辛醚、冰片、苏合香挥发油、麝香酮均可促进替莫唑胺（TMZ）进入人胶质瘤U251细胞内，增强TMZ抑制肿瘤细胞增殖并促进细胞凋亡的作用，其机制可能是降低P-糖蛋白（P-gp）、多耐药基因1（MDR1）的表达。Duan等[3]发现冰片可提高抗肿瘤药物顺铂的脑组织瘤区转运，其中下调紧密连接相关蛋白-1（ZO-1）、F-actin的基因及蛋白表达可能是其重要的作用机制之一。邢燕梅[4]证实天然冰片是通过激活Raf/MEK/ERK/MAPKs信号转导通路，进而调控下游相关紧密连接蛋白Claudin-5、ZO-1、F-actin的基因、蛋白表达和分布，从而调节脑血瘤屏障（BBTB）的通透性。
川芎Ligusticum chuanxiong Hort. 辛散温通、气香走窜，能上行巅顶、下行血海、旁达四末、外彻皮肤，既能活血化瘀，又能行血中气滞、疏散风邪，为血中之气药。吴霜霜等[5]分析了脑肿瘤中药用药规律，结果除全蝎和茯苓外，川芎的使用频率最高。含有川芎的中药复方在临床上也常用于脑胶质瘤的治疗，如脑瘤散、自拟脑瘤康[6]、自制胶质瘤方[7]、川芎三白汤[8]、涤痰化瘀通窍汤[9]、补阳还五汤[10]、平瘤合剂[11]等。这些研究提示，川芎可能具有促进配伍成分透血脑屏障（BBB）/BBTB，提高脑内、瘤内药物治疗浓度的作用。本课题组前期研究了川芎挥发油（VO）中的3个入脑成分藁本内酯、洋川芎内酯A和洋川芎内酯I对BBB的调节作用，发现这3个成分可抑制BBB上P-gp蛋白的外排作用，增加配伍药物芍药苷、天麻素跨膜转运量[12]。基于此，本研究制备C6胶质瘤大鼠模型，对比TMZ单给药、VO与TMZ配伍给药后，模型大鼠的体质量变化、生存状态、肿瘤体积的变化及抑瘤率，从药效学的角度研究VO是否具有提高配伍药物抗胶质瘤的作用；对比TMZ单给药、VO与TMZ配伍给药后，TMZ在胶质瘤细胞U87-MG内、外液中的浓度，Western blotting法研究VO与TMZ配伍给药后对U87-MG细胞中外排蛋白P-gp表达的影响，阐明其作用机制。
1 材料
1.1 药品及试剂
TMZ，批号K19A9B58889，源叶生物科技有限公司；VO，批号20170614，其中总内酯质量分数为50.27%，藁本内酯质量分数为30.67%，陕西昊辰生物科技有限公司；聚山梨酯-80，Solarbio公司；ECM基础培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素双抗，Sciencell公司；Ham’s F-12K培养基、马血清，美国Hyclone公司；FBS，美国Gibco公司；胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、Hanks缓冲液、固体石蜡、树胶、磷酸盐缓冲液（PBS）、4×蛋白上样缓冲液、0.22 μm PVDF膜、1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8、1 mol/L Tris-HCl pH 6.8、10×电转液、5×Tris甘氨酸电泳缓冲液、牛血清白蛋白（BSA）、20×TBS、彩虹245 plus广谱蛋白Marker，Solarbio公司；P-gp抗体（Abcam公司）；GAPDH抗体、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG、HRP辣根酶标记山羊抗兔IgG，北京中杉金桥生物技术有限公司；化学发光剂、BCA试剂盒，天根生化科技有限公司；二甲苯、无水乙醇、甲醛均为西陇科学股份有限公司产品。
1.2 仪器
AE31倒置生物显微镜，麦克奥迪实业集团有限公司；01220数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；Forma 3111二氧化碳恒温培养箱，Thermo Electron公司；3-18K离心机，德国Sigma公司；Agilent1260高效液相色谱仪，美国Agilent公司；多功能酶标仪，Thermo公司；冰箱，青岛海尔股份有限公司；脑立体定向仪，德国Kopf公司；电动牙科钻，美国Foredom公司；微量注射
泵，美国KD Scientific公司；RM2255型包埋机、EG1150H型切片机、HI1210型摊片机、HI1220型烘片机均为德国莱卡公司产品；BX43型光学显微镜，日本Olympus公司；A-35型刀片，日本Feather公司；DNP-9052电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；GL-6250A磁力搅拌器、TS-8脱色摇床，海门其林贝尔仪器制造有限公司；1645050电泳电源、1658001垂直电泳槽，BioRad公司；Chemiscope 6000 Pro荧光及化学发成像系统，上海勤翔科学仪器有限公司。
1.3 细胞及动物
大鼠C6胶质瘤细胞，上海中乔新舟生物科技有限公司；U87-MG细胞，北京北纳创联生物技术研究院；SPF级雄性Wistar大鼠，体质量220～240 g，南京君科生物科技有限公司，实验动物许可证号SCXK（沪）2013-0016，由江西中医药大学实验动物中心按SPF级动物标准饲养。
2 方法
2.1 细胞培养及处理
C6细胞加入适量含有15%马血清、2.5% FBS的Ham’s F-12K培养液，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。取对数期细胞，常温下经0.25%胰酶消化，吹打细胞制成细胞悬液，将细胞转置于离心管中，细胞计数板计数，用台盼蓝排斥实验确定细胞存活率，需存活率＞95%。离心管中剩余细胞以1 000r/min离心3 min，弃去上清液，调整细胞密度为7×107个/mL用于接种。U87-MG细胞培养基为含10% FBS的DMEM，培养方法同C6细胞。
2.2 大鼠脑胶质瘤模型的制备
术前12 h大鼠禁食、不禁水，用10%水合氯醛（3.5 mg/kg）ip麻醉，俯卧固定于大鼠脑立体定位仪，剔去头部皮毛，酒精进行术区消毒，以内眦连线与头部正中矢状面交点位置右移3 mm，向后做约1.5 cm的纵向切口，分离皮下组织与骨膜，充分暴露颅骨。据Batker法确定右尾状核靶点，于冠状缝与正中矢状线交点前1.0 mm、中线右3.0 mm处用电钻钻一小孔，不可伤及硬脑膜及脑组织。25 μL微量注射器吸取已准备好的待用C6细胞悬液15 μL（约1×106个细胞），放置于微量注射泵上，沿电钻钻开的骨孔缓慢垂直进针至硬膜下6.0 mm，1.0 min后再回退1.0 mm（距硬膜下5.0 mm）。将注射速度设置为1.5 μL/min，10 min推注完毕，需再留针5 min，使细胞充分沉积，再缓慢退针，退针速度为2 μL/min，骨孔用骨蜡进行封闭。缝合切口后用碘伏再次消毒皮肤。
2.3 大鼠分组与给药
大鼠接种C6细胞2周后，随机抽取5只，取瘤区脑组织做病理切片，判断模型复制是否成功。若镜下见梭形细胞呈浸润性生长，细胞异型性明显，核分裂相易见，肿瘤微血管丰富，中心有明显的出血及栅栏状坏死，表明造模成功。随机将制备成功的模型大鼠分为模型组（给予双蒸水）、TMZ组（25 mg/kg）、TMZ＋VO低剂量组（TMZ/VO 2.5，25 mg/kg＋2.5 mg/kg）、TMZ＋VO高剂量组（TMZ/VO 5，25 mg/kg＋5 mg/kg），每组15只，ig给药，连续给药5 d，给药体积为10 mL/kg。
2.4 大鼠生存状况观测
从造模第1天开始至给药结束后，每日观察、记录大鼠的精神状况、活动情况、体质量变化、行为改变等生存质量情况。
2.5 大鼠肿瘤病理学研究
将给药后的大鼠每组取3只，10%水合氯醛过量麻醉，颈椎脱臼处死，取脑，生理盐水清洗干净，固定于10%甲醛固定液中2 d，石蜡包埋、切片（厚度为3 μm），HE染色，光学显微镜下观察肿瘤的形态学变化。
2.6 大鼠胶质瘤体积及抑瘤率测定
各组大鼠给药后10%水合氯醛麻醉，仰卧位固定，以横膈肌处为起点，将胸部皮毛、肌肉组织剪开，切开纵膈肌，将两侧肋骨剪断，用止血钳夹住前胸肋骨剑突向上翻起，以便暴露心脏，用镊子将心脏固定，将灌注针从左心室插入主动脉弓起始部，用止血钳固定心脏及针头，剪开右心耳，先用300 mL 37 ℃生理盐水进行快速灌注，再用200 mL 4%多聚甲醛固定液20 min内匀速灌注。灌注完毕后，开颅，将脑组织完整取出，在4%多聚甲醛溶液内固定1周。将肿瘤组织从脑内完整的剥离取出，称质量，并测量肿瘤短径（a）和长径（b），计算肿瘤体积（V）及肿瘤体积抑制率，肿瘤体积抑制率＞30%，表明肿瘤对药物敏感。
V＝a2×b×π/6
肿瘤体积抑制率＝(V模型－V治疗)/V模型
2.7 U87-MG细胞分组与给药
取U87-MG细胞制成细胞悬液，调整为2.0×105～2.5×105个/mL，接种于6孔板中，每孔2 mL，待细胞融合至80%后，分为TMZ组（20 μg/mL）和TMZ＋VO低、中、高浓度（20 μg/mL＋1.562 5×10−3、3.125×10−3、6.25×10−3 μL/mL）组，移液枪吸尽每个孔中的培养液，分别加入2mL相应溶液。培养24 h后，收集培养上清液即为细胞外液。胰酶200 μL对贴壁细胞进行消化，消化5 min，1 200 r/min离心5 min，超声3 min，1 200 r/min离心5 min后取上清液即为细胞内液。吸取100 μL的细胞内、外液，加入100 μL醋酸乙酯，涡旋5 min后，再以12 000 r/min于4 ℃离心10 min，取上清液采用HPLC检测。
2.8 HPLC测定细胞内、外液中TMZ水平
2.8.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex Kinetex NB-C18柱（100 mm×3.0 mm，2.6 μm）；流动相乙腈-0.1%甲酸水1∶9，体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；进样量5 μL，检测波长为329 nm。
2.8.2 方法学考察
（1）专属性考察：精密吸取TMZ对照品、Hanks液、细胞内液及细胞外液样品，按“2.7”项下方式进行处理，在“2.8.1”项下色谱条件下进样5 µL进行检测，考察专属性。TMZ在此液相条件下，保留时间为5.5 min左右，Hanks溶液对TMZ的测定无干扰。
（2）精密度试验：取适量的TMZ对照品储备液，制成质量浓度为1.25、5、10、20μg/mL溶液，按“2.8.1”项下色谱条件进样测定，连续进样6次，测定其峰面积，结果TMZ的峰面积RSD分别为2.17%、0.76%、0.86%、1.05%，表明仪器的精密度良好。
（3）回收率试验：取TMZ对照品溶液，加双蒸水配制成低、中、高3个质量浓度；取TMZ对照品溶液，加Hanks液配制成低、中、高3个不同质量浓度溶液，按“2.7”项下处理方法进行操作，平行配制3份，按“2.8.1”项下色谱条件，精密进样5 µL，测定峰面积，计算回收率和RSD值。结果TMZ低、中、高浓度的回收率分别为83.0%、85.3%、85.1%，RSD值分别为2.34%、4.66%、4.28%。表明回收率良好。
2.9 Western blotting法检测P-gp蛋白表达
U87-MG细胞制成细胞悬液，以1.0×106个/mL接种于25cm2培养瓶中，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养，细胞生长融合至90%后，分为对照组、TMZ组（20μg/mL）和TMZ＋VO低、中、高浓度（20 μg/mL＋1.5625×10−3、3.125×10−3、6.25×10−3 μL/mL）组。药物作用8h后，RIPA法裂解并提取蛋白，−20 ℃保存。采用Western blotting法检测P-gp蛋白表达，灰度分析使用Image J软件进行分析。
2.10 统计学分析
采用SPSS21.0统计软件分析，数据以表示，2组间结果比较釆用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVE）。
3 结果
3.1 大鼠的体质量变化及生存状态分析
结果见图1，造模前各组大鼠体质量无统计学差异，造模后当天给予充足饲料，第2天观察大鼠已开始自行觅食、饮水。术后大鼠食物和水的摄入较术前均有减少。模型组大鼠术后出现精神状态萎靡不振，毛发不整洁、黯淡无光，反应迟钝，活动量减少，聚集成堆等表现，个别伴有腹泻等症状，体质量下降明显；7～14d大鼠暴躁易怒，攻击力增强，多数有明显的脑部肿起，部分出现眼眶周围出血、鼻出血、偏瘫等颅内高压的症状。TMZ、TMZ/VO2.5和TMZ/VO 5组大鼠术后14 d内精神状态及颅内高压症状表现与模型组相同，连续给药5 d后，部分大鼠头部的肿起逐渐消失，毛发光泽度较模型组光亮；14 d后给药组大鼠体质量有缓慢上升的趋势，TMZ/VO 2.5和TMZ/VO 5组大鼠给药后体质量比模型组及TMZ组大鼠上升更快，与模型组比较差异显著（P＜0.05）。
3.2 大鼠脑胶质瘤形态学变化
HE染色结果见图2，模型组大鼠肿瘤细胞排列非常紧密，细胞体积较大，可见裸核，核体积大，核浆的比例有所增加，有大量的异型性细胞增殖，并向脑组织呈浸润性生长，多见不成熟新生血管，病灶中心部位坏死灶和出血。TMZ、TMZ/VO 2.5和TMZ/VO 5组大鼠脑组织中肿瘤体积明显缩小，TMZ/VO2.5和TMZ/VO 5组大鼠脑胶质瘤细胞排列紧密程度显著轻于模型组，与TMZ组比较细胞密度也略有降低。
3.3 大鼠肿瘤体积及其抑制率
连续给药5 d后，与模型组比较，TMZ、TMZ/VO 2.5和TMZ/VO5组大鼠脑胶质瘤体积明显减小（P＜0.05、0.01），见图3。TMZ、TMZ/VO 2.5、TMZ/VO 5组大鼠肿瘤抑制率分别为55.23%、63.56%、74.66%，所有给药组肿瘤体积抑制率均＞30%，表明肿瘤对治疗敏感。TMZ/VO 5、TMZ/VO2.5组与TMZ组比较差异显著（P＜0.05），提示与VO配伍后可以提高TMZ的抗肿瘤效果，且呈剂量依赖性，表明VO增强TMZ抗肿瘤效果与给药剂量有关。
3.4 VO对U87-MG细胞内、外液中TMZ浓度的影响
表1结果可以看出，VO可以促进TMZ进入U87-MG细胞内液中，且随着VO浓度的增加，促进作用越强。其中VO 6.25×10−3 μL/mL可显著增加TMZ在细胞内液中的蓄积（P＜0.05）。
3.5 TMZ配伍VO对U87-MG细胞P-gp蛋白表达的影响
U87-MG细胞分别经空白Hanks液、TMZ、不同浓度VO配伍TMZ处理后，细胞膜上P-gp蛋白表达情况见图4。结果发现，与对照组比较，TMZ对P-gp蛋白表达无显著影响。与TMZ组比较，TMZ与VO 3.125×10−3、6.250×10−3 μL/mL配伍后可显著降低P-gp蛋白表达水平（P＜0.05、0.01），表明VO通过抑制外排蛋白P-gp蛋白表达，增加TMZ进入胶质瘤细胞膜内的浓度，从而提高胶质瘤的治疗效果；同时该抑制作用与VO用量呈正相关，用量越大，抑制作用越强。
4 讨论
脑胶质瘤是最常见的颅内恶性原发性脑肿瘤，致死率高，由于其浸润性生长，和正常脑组织没有明显界限，手术难完全切除，对放疗、化疗不甚敏感，因此脑胶质瘤至今仍是全身肿瘤中预后最差的肿瘤之一。研究者利用肿瘤表面特异性高表达的受体作为药物递送系统作用靶点构建一级靶向[13-15]给药系统，以及在一级靶向的基础上增加脑靶向的二级靶向[16-18]。虽然临床前实验结果显示了这些靶向制剂的优越性，但由于系统的合成制备相对来说比较复杂，可控性差，存在安全性等诸多问题[19]，可能会限制其在体内的应用及向临床的转化。中医药在治疗脑肿瘤时常常配伍使用芳香开窍药，利用芳香开窍药对BBB/BBTB的调节作用可提高配伍药物的疗效，并随着该作用机制的逐渐阐明，现已广泛与化学药物联用发挥协同作用，成为治疗脑肿瘤的有效途径。目前研究较多的芳香开窍药如β-细辛醚、冰片、苏合香挥发油、麝香酮等，被发现能增加配伍药物抗胶质瘤的效果[2]。
川芎可提高酸枣仁皂苷A和天麻苷元在脑组织中的浓度，并延缓其在脑组织中的代谢[20-21]。川芎中的川芎嗪可以通过降低咬合蛋白（occludin）、闭合小环蛋白（ZO-1）表达从而增加BBB的通透性[22]。川芎嗪的转运受到P-gp的外排作用，但与其他药物配伍使用时，川芎嗪能通过抑制P-gp的表达来促进药物透过BBB[23-24]。VO中的3个入脑成分藁本内酯、洋川芎内酯A和洋川芎内酯I可抑制BBB上P-gp蛋白的外排作用，增加配伍药物芍药苷、天麻素跨膜转运量，同时还可以抑制ZO-1和Claudin-5蛋白的表达，增加BBB的通透性，从而增加配伍药物的跨膜转运。由于胶质瘤的治疗同时受到BBB/BBTB生物屏障作用及外排蛋白耐药性的影响，推测川芎可能同样有协同配伍药物治疗胶质瘤的作用[12,25-26]。
基于此，本研究制备了C6胶质瘤大鼠模型，连续给药5 d后，TMZ、TMZ/VO 2.5和TMZ/VO 5组部分大鼠头部的肿起逐渐消失，毛发光泽度较模型组更加光亮；各给药组大鼠体质量有缓慢上升的趋势，TMZ/VO 2.5和TMZ/VO 5组大鼠比模型组及TMZ组体质量上升更快，与模型组比较差异显著（P＜0.05）。另外，与TMZ组比较，TMZ/VO 2.5、TMZ/VO 5组大鼠肿瘤体积显著减小（P＜0.05），提示VO配伍TMZ给药时，可以增强TMZ的药效，提高脑胶质瘤的抑制率，且呈剂量依赖性。
TMZ及VO对胶质瘤细胞活性的影响较大，预试验时，TMZ 20 μg/mL组细胞存活率为97.85%、而浓度增加到40 μg/mL时，细胞存活率降至77.64%；而VO 6.25×10−3 μL/mL配伍TMZ 20 μg/mL时，细胞存活率为73.70%，当VO增加到12.5×10−3μL/mL时，细胞存活率降为52.65%，为保证细胞存活率，用于检测细胞内、外液中TMZ的浓度，VO在体外细胞实验时浓度选择比体内实验时低很多。HPLC检测TMZ配伍VO对细胞内外TMZ含量的影响，结果显示VO可以促进TMZ细胞进入U87-MG细胞内液中，且随着VO浓度的增加，促进作用越强。其中VO 6.25×10−3 μL/mL可显著增加TMZ在细胞内液中的蓄积（P＜0.05）。Western blotting实验结果表明，VO通过抑制外排蛋白P-gp蛋白表达，增加TMZ进入胶质瘤细胞膜内的浓度，从而提高胶质瘤的治疗效果；同时该抑制作用与VO用量呈正相关，用量越大，抑制作用越强。
本研究探讨了VO通过抑制P-gp蛋白表达，促进TMZ进入胶质瘤细胞内部，从而发挥协同增效的作用，为临床脑胶质瘤的治疗提供一定的实验和理论基础，但其协同机制是否与紧密连接蛋白以及其他转运蛋白有关，仍有待于进一步深入研究。
来源：中草药杂志社
参考文献（略）
来 源：吴海霞，刘姗姗，胡鹏翼，李 菁，钟 钰，郑 琴，杨 明. 川芎挥发油调控P-糖蛋白协同替莫唑胺的胶质瘤治疗作用及机制 [J]. 中草药, 2019, 50(22):5492-5498.
