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林曉青组Angew | 双功能CytP450催化烯炔的形成-环己烯类萜烯Asperpentyn的生物合成研究2020-05-19
遇见/摘要

烯炔是有机化学中的重要官能团,尤其在点击化学领域。Asperpentyn(1)是分离自Aspergillus 和 Pestalotiopsis 的含1,3-烯炔的环己烯类萜烯。本文鉴定了1的生合基因簇aty 并表征了1的生物合成中的两个关键酶。研究人员发现了一种双功能P450单加氧酶AtyI,其首先催化异戊二烯链的脱氢反应生成顺式二烯中间体,然后显示乙炔酶活性形成1,3-烯炔部分。本文还表征了UbiA型异戊二烯基转移酶AtyB,少见的将单个C5而不是多C5转移到底物对羟基苯甲酸上。

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遇见/内容

烯炔是有机合成,功能材料和药物化学中的重要官能团。生物活性分子和药物制剂中也常见1,3-烯炔部分,1,3-烯炔可以经历各种化学转化以产生碳-碳键,尤其在点击化学领域应用广泛。天然产物中炔类的生物合成已有文献报道(fig 1A,也可见文末相关烯炔的往期推荐:3, 4),然而,酶如何催化形成1,3-烯炔仍然是一个难题。

Fig 1. (A) Structures of representative acetylenic NPs.

土壤真菌Aspergillus sp. PSU-RSPG185生产一系列含1,3-烯炔的环己烯类萜烯,如asperpentyn (1, Fig 1B) 和eutypinic acid (2)。其它的如pestalodiols E and F 以及植物毒素 eutypine(导致葡萄枯萎)等。理解产生1,3-烯炔部分的酶促过程和反应机理具有重要意义。尽管1,3-烯炔在环己烯类萜类化合物中普遍存在,但其生物合成途径和相关酶仍然未知。

Fig 1. (B) examples of 1,3-enyne-containing cyclohexanoid terpenoids

本文对进行基因组测序,比较基因组分析,产物结构分析,生物信息学分析以及文献调研,搜索了包含异戊二烯基转移酶和VibMO1单加氧酶(此酶的生物合成相关内容详见往期推荐1,2)同源序列的基因簇,获得了一个候选基因簇aty。该簇含有编码UbiA异戊二烯基转移酶(atyB)、UbiH水杨酸羟化酶(atyG,与VibMO1的同一性/相似性为38%/56%),AtyH(同源基因可将L-苯丙氨酸转化为肉桂酸)、铜蛋白氧化酶AtyE、SDR家族蛋白AtyC和醛还原酶AtyD。

Fig 2. Identification of the aty gene cluster from Aspergillus sp. PSURSPG185.

为了验证该簇中剩余两个酶AtyI和AtyA的功能,研究人员将其在Saccharomyces cerevisiae strain BJ5464-NpgA(含有CytP450还原酶AtCPR)进行异源表达,同时共表达了两种潜在的上游酶AtyB和AtyH。不同组合方式的异源表达结果表明,从5到烯炔2的生物合成涉及两种酶:UbiA异戊二烯基转移酶和CytP450单加氧酶。

Fig 2. (B) LC-DAD-MS analysis of the extracts of S. cerevisiae.

为了证实AtyB的功能,研究人员从过表达酿酒酵母的atyB中制备了微粒体提取物(AtyB可能与膜结合)。将5和AtyB与DMAPP和镁离子一起孵育形成4,随后研究人员评估了具有不同链长的异戊烯基焦磷酸酯,发现AtyB可以将C10和C15异戊烯基长链接入到5。体外多底物竞争性实验表明,尽管AtyB可以转移较长链的聚戊二烯,但其更倾向于C5的DMAPP作为底物。结合系统发育分析,表明AtyB是一种少见的UbiA异戊二烯基转移酶,更倾向于转移短(C5)异戊二烯。

Fig 3. Verification of the function of AtyB.
为了表征AtyI的功能,研究人员进行了异源表达和体外表征。将4喂给表达atyI的酿酒酵母后,发现4转化为2图4A)。体外实验同样也说明结AtyI是负责将烯炔官能团插入1的关键乙炔酶。为了解AtyI催化形成烯炔的机理,本文合成了一系列底物衍生物。底物饲喂发现8转化为19图4C),表明C-4 O-甲基化可能影响中间体在AtyI活性位点的结合,以进行第二次氧化。将1618饲喂表达atyI的酿酒酵母后,观察到了相应的转化(图4D, E)。以上结果表明,由AtyI催化的异戊二烯基上1,3-烯炔部分的形成是通过顺二烯中间体。

Fig 4. Verification of the function of AtyI.

至此,本文提出AtyI首先从C-7烯丙基位置攫氢并形成中间体a方案1A),7,8键旋转后,向C-9的自由基转移形成7,8顺丁烯自由基b。甲基末端的攫氢产生7,8-顺二烯A,之后AtyI将7,8-烯基氧化为炔烃,得到2。同时,本文也将参与转化的其它化合物的催化机制进行总结(方案1B),提出了化合物1完整的生物合成(方案2)。

Scheme 1. Proposed mechanisms of AtyI with (A) 4, (B) 8, (C) 16 and (D) 18.

Scheme 2. Proposed biosynthetic pathway for asperpentyn (1).

综上,本文确定了1的生物合成基因簇,并表征了1生物合成中的两个关键酶,发现了具有双功能的P450单加氧酶,其首先催化异戊二烯链的脱氢反应生成顺式二烯中间体,然后显示乙炔酶活性产生炔烃部分。

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