▲第一作者：徐泽菲，姚培圆；通讯作者：朱敦明，吴洽庆
通讯单位：中国科学院天津工业生物技术研究所论文DOI：10.1021/acscatal.0c02400
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手性七元氮杂环化合物因广泛应用于天然产物和药物的合成而备受关注，其中手性1,4-二氮䓬是多种药物的重要结构单元。本文通过酶库筛选及蛋白质工程获得了两个立体选择性互补的亚胺还原酶，首次通过亚胺还原酶催化分子内不对称还原胺化反应实现了手性1,4-二氮䓬类药物关键中间体的不对称合成，并通过密度函数计算及分子动力学计算，揭示了突变酶催化活力提高的主要原因是酶与NADPH相互作用的改变，为提高NAD(P)H依赖型氧化还原酶的活力提供了一个新的有效改造策略。
背景介绍
失眠是最常见的一种睡眠障碍，在成年人群中发病率高，超过3亿中国人有睡眠障碍。苏沃雷生是一类新型的催眠药，2014年获得美国FDA批准用于治疗难以入睡或维持睡眠的首个食欲素受体拮抗剂。临床研究表明，对抗抑郁类镇静药和苯二氮䓬类镇静药产生耐药性的失眠患者，苏沃雷生的治疗效果良好。苏沃雷生的关键结构单元是一个手性1,4-二氮䓬环，但其高效不对称合成仍然是具有挑战的课题。亚胺还原酶是一类NAD(P)H依赖型的氧化还原酶，可以催化潜手性亚胺不对称还原生成相应的手性胺，是手性胺合成领域极具潜力的一类生物催化剂。本论文首次利用亚胺还原酶催化氨基酮底物的分子内还原胺化制备手性1,4-二氮䓬类化合物。
研究出发点
创新发展生物催化技术，实现传统化学法难以实现或污染严重的反应，阐明生物催化剂的手性控制机理，建立相关药物及精细化学品的绿色合成工艺，促进化学工业的可持续发展一直是我们研究团队的目标。发展亚胺还原酶催化不对称合成手性1,4-二氮䓬类化合物，不仅可以解决现有药物的合成难题，也可以为新药开发提供新的结构模块。
图文解析
首先利用苏沃雷生关键中间体的前体为模式底物，筛选实验室前期已建立的亚胺还原酶库，发现两个酶表现出互补的立体选择性，（R）-或（S）-构型产物的对映体过量值均大于99%，催化效率分别为0.027 s −1 mM −1和0.962 s−1 mM−1。苏沃雷生中间体为R构型，而（R）-选择性亚胺还原酶的低活力促使我们对其进行蛋白质工程改造。该酶是生物代谢途径的喋啶还原酶，已有晶体结构报道。我们将本论文底物对接到酶的活性中心，选择底物与辅酶周围25个氨基酸残基进行单点饱和突变，其后再对筛选到的单点突变进行简单组合，获得了催化效率提高61倍的双突变体Y194F/D232H（Table 1）。
▲Table 1 Kinetics parameters of mutants of IR1 towards 3aa
为揭示突变酶催化活力提高的原因，我们进一步与斯德哥尔摩大学盛翔博士及所内李金龙助理研究员合作进行计算分析。采用量子化学团簇方法进行密度函数计算，显示突变体中氢转移的能量势垒较野生型降低了 2.7 kcal/mol, 与实验结果吻合。通过比较过渡态的优化结构，确定了影响活性提高的一个主要因素是酶与NADPH相互作用的改变，即232位组氨酸残基的侧链与NADPH的酰胺基形成氢键，稳定了氢化物转移的过渡态（Figure 1）。利用分子动力学模拟预测了酶分子与底物的结合自由能，整体趋势和实验测得的Km值一致。
▲Figure 1. Optimized structures of the transition states for the hydride transfer in WT enzyme and Y194F/D232H mutant.
随后用该突变体进行实验室规模制备反应（100 mL），1.0 g湿菌在10 h能够转化100 mM 底物获得苏沃雷生中间体，产物收率及对映体过量值分别为81%和99%。并利用立体选择性互补的两个酶合成了一系列具有不同结构特征的手性1,4-二氮䓬类化合物 (Table 2)。
▲Table 2 Preparative-scale reductive amination for the synthesis of various 1, 4-diazepanes a
总结与展望
我们通过筛选48个亚胺还原酶，实现了酶促分子内不对称还原胺化反应构建具有生物活性的手性1,4-二氮䓬类化合物。之后利用蛋白质工程改造，成功得到催化效率显著提高的突变体，在制备规模反应中转化了100 mM底物，为重要药物中间体的合成提供了一种更绿色经济的方法。计算分析揭示了突变酶催化活力提高的主要原因是酶与NADPH相互作用的改变，为提高NAD(P)H依赖型氧化还原酶的活力提供了一个新的有效改造策略。利用立体选择性互补的两个酶合成了一系列具有不同结构特征的手性1,4-二氮䓬化合物，为该类具有重要生理活性的手性结构模块的精准构建提供了一种有效的生物催化方法。
心得与体会
生物催化是化学、生物及计算等多学科交叉的学科，选择一类有价值的底物是课题开展的起点，而筛选及改造获得优异性能的酶，能为底物转化提供有力的工具，计算分析则能从分子基础去解析反应本质。完成本论文的过程，深刻体会到团队的重要性，有多学科科研人员的指导、交流，才能取得一个更完整的研究成果。另外一个体会就是前期工作积累的重要性，构建的野生酶库为获得目标酶提供了基础，我们的酶库仍然在不断积累扩充中，期待未来应用到更多类型目标产物的生物催化合成工艺中。
研究团队介绍
中国科学院天津工业生物技术研究所生物催化与绿色化工研究团队由朱敦明研究员带领的生物催化反应机理解析及应用研究组和由吴洽庆研究员带领的生物催化剂发现与改造研究组组成，团队科研人员16人、博士和硕士研究生12人、博士后2人，其中拥有理学、工学博士学位人员8人，正高级研究人员3人、副高级研究人员3人。创新发展生物催化技术，实现传统化学法难以实现或污染严重的反应，阐明生物催化剂的手性控制机理，建立相关药物及精细化学品的绿色合成工艺，促进化学工业的可持续发展一直是我们研究团队的目标。
近年来实现了甾体药物、氨基酸、手性醇和手性胺等重要药物中间体的多项生物催化合成技术转让，为企业创造了经济价值，为其节能减排、转型提升做出了贡献。现承担国家自然基金、国家重点研发计划项目共4项，中科院和天津市科研项目各2项及企业合作项目多项，建有2个企业联合实验室。欢迎有志于从事生物催化研究的生物化学与分子生物学、微生物学、合成生物学、有机合成化学等专业的学生报考研究团队的硕士、博士研究生，拥有上述专业博士学位的青年才俊加入我们的研究团队，共同努力实现把科研成果写在祖国大地上的梦想。
研之成理
