第一作者：Qian Li
通讯作者：Chengde Mao
通讯单位：Department of Chemistry, PurdueUniversity
ADNLab1. 研究背景
沃森-克里克碱基互补规则预测了DNA双链的形成。氢键的排列和取向的变化衍生出了多种DNA结构如三链体，G-四链体和i-motif。研究发现，有机分子或聚合物也可以与碱基形成氢键从而与DNA相互作用。如McLaughlin小组通过使用一种聚合物设计了Janus-Wedge DNA三链体，其中每个楔形残基与目标碱基对形成一个氢键合的三联体；而Bong和他的同事发现聚胸腺嘧啶(PolyT)和聚三聚氰胺肽可以生成三链体。最近，Sleiman及其同事发现，氰尿酸（CA）分子可以介导聚腺嘌呤三链体的形成。这些替代结构为DNA提供了丰富的化学成分，并为生物过程中的材料应用和调控途径提供了机会。
本文中，作者发现三聚氰胺(MA)可以通过T-MA-T介导两条聚胸腺嘧啶DNA链形成反平行的双链体。该相互作用可以实现MA的高灵敏检测并且可以编码DNA瓦片组装为特定的纳米结构。而且DNA-小分子组装较沃森克里克碱基对具有更高的动态性，而且稳定性可调节。ADNLab2. 图文解读
1. PolyT-MA双链的结构
MA含有三个可以与胸腺嘧啶形成氢键的对称的边，因此作者假定MA可以与PolyT相互作用形成双链或三链体（图1）。将MA与PolyT混合退火后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），实验结果如图2a-c。25℃时，不加入MA，PolyT链以预期的迁移速率迁移。在加入10 mM MA时，T20和T30的迁移变慢，表明其可能与MA形成的多链复合物。但是在升高温度至37℃后，所有的PolyT链均与单链的迁移速率相同表明多链复合物发生解链。T10-MA由于其熔点温度较低所以在添加MA前后保持相同的电泳迁移率。
图1 MA与T通过氢键可能形成的复合物。a，b，T2-MA异源三聚体（a），T3-MA异源四聚体（b）分别会形成PolyT同源双链以及PolyT同源三链体。
之后，为了确定PolyT-MA复合物中DNA的数量和取向，作者设计了1个发卡分子H（图2d，e）。发卡H的中部为沃森-克里克碱基配对的茎，尾部为2个T20。如果PolyT-MA为三链体结构，H会保持单体的结构，如果为双链结构，发卡则会形成双链复合物。PAGE结果表明在有MA的情况下，H的迁移速率只比无MA情况下稍快。该差距表明H在MA存在的情况下保持其单体结构，PolyT-MA为反平行双链。当H与T20在10 mM MA的情况下混合孵育后，PAGE结果只显示H-MA和T20-2-MA的条带，表明形成了反平行的双链结构。作者将形成双链体而非三链体的结构归因于位阻与DNA链之间的静电排斥。
图2 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析PolyT与MA的相互作用。a-c，改变MA的浓度或温度：0 mM MA 25℃（a），10 mM MA 25℃（b），10 mM MA 37℃（c）。d，e，检测MA诱导的DNA发卡的折叠：0 mM MA 25℃（d），10 mM MA 25℃（e）。
后续，作者通过CD光谱、动态光散射对PolyT-MA进行表征并确定了结合比为T:MA=2:1。X射线晶体学实验显示了PolyT-MA的详细结构。两个T6链和6个MA分子形成反平行右手螺旋的双链的半个螺旋，包括6个连续的T-MA-T三聚体。而且T-MA-T的几何结构和氢键长度与C-G-C+三聚体类似。
T6-MA的双链形态与DNA三链体相似，其中两个T6链的取向与三链体中外部polyC/PolyT链类似，MA的取向则与内部PolyG/PolyA类似。PolyT-MA的形态与A型和B型DNA不同，一个完整的PolyT-MA螺旋的长度为12 bp。在晶体中，双链堆积以头尾相连的方式堆积（图3f，g）。相邻列中的双链彼此在大沟上结合。
图3 T6-MA复合物的晶体学图像研究。a，T6-MA双链示意图。b，T6-MA晶体的光学图像。c，T6-MA双链体的结构模型。d，MA介导的T-T碱基对的细节。e，立体图像显示，PolyT-MA双链在晶体中彼此在大沟结合。f，g，分别沿三重螺旋轴（f）和四重螺旋轴（g）观察的T6-MA晶体中的晶体堆积。
DNA长度和MA浓度都对poly（T）-MA双链体的稳定性有正影响。随DNA长度增加，Poly（T）-MA双链的熔点逐渐上升（T10-MA，21.5℃；T20-MA，36℃；T30-MA，39.8℃）。随着MA浓度增加，Poly（T）-MA双链体的熔点也逐渐上升（T30-MA，1 mM MA，19.8℃；5 mM MA，33℃；10 mM MA，39.8℃）。溶液pH也会对poly（T）-MA复合物的稳定性产生影响，当pH从8.0降低到5.0时，T30-MA双链的熔点从39.8上升到了53.3℃，可能是由于MA的质子化。质子化MA上的正电荷与胸腺嘧啶碱基中的富电子酮氧或DNA主链的负电荷之间的静电吸引可能有助于在较低pH值下稳定Poly（T）-MA双链体。
2. 动态链置换
热力学上PolyT-MA双链不如A-T双链稳定，但是比相同长度的A-T-T三链体稳定。例如，当将PolyA，PolyT和MA混合，PolyA与PolyT形成常规的PolyA-PolyT双链，而不是PolyT-MA双链。同样，当PolyT-MA双链体和PolyA混合时，PolyA置换MA以生成PolyA-PolyT双链体并释放MA。
CA可以与MA形成平面氢键网络。作者假定CA的作用机理与PolyA类似，但是实验结果表明加入CA后，形成白色沉淀，上清液中无CD信号。后续利用红外光谱证明PolyT掺杂在MA-CA沉淀中。在该沉淀中加入PolyA会在上清液中发现PolyA-PolyT双链的信号。
3. 分子间作用力
通过单分子打开实验来检测PolyT-MA的分子间作用力。作者合成了一个具有4碱基Loop和4个G-C碱基对的茎的发卡，发卡的茎延伸出20 bp的T-T错配。整个发卡结构被夹在两个长链的DNA把手之间。DNA把手被固定在两个光阱的微球上（图4a）。作者通过以每秒5.5 pN的加载速度移动其中一个微球来增加对结构的拉力直到发卡打开，并收集了相关力与拉伸距离（F-X）数据，打开力反映出结构的分子间作用力。
在MA存在的情况下,该DNA结构表现出两种类型的打开特征，在第一种类型中该结构展现出一种打开特征，在第二种类型中，该结构表现出两种连续的打开特征（图4c）。后续，作者分析了打开力与轮廓总长（图4d）。观测到的打开力比富A-T碱基对的发卡的打开力高，表明T-MA-T结构稳定了发卡，而且T-MA-T结构的分子间作用力比A-T碱基间的强。该增强可能是由于额外的π-π堆积作用造成的。打开距离的变化大部分均小于打开完全闭合发卡的距离变化，表明并非所有的T-T错配均与MA形成的复合物，这与在较低的MA浓度下发夹形成的可能性减少的结果一致（图4e）。
图4 PolyT-MA双链的分子间作用力检测。a，包含20个T-T错配的T-MA-T形成的DNA结构示意图。b，在发夹茎中含有20个A-T碱基对的对照DNA结构的示意图。c，不使用MA或使用MA（100 µM）的20T-T和20 A-T DNA结构的代表性F–X曲线。d，在存在100 µM MA的情况下，20 T-T结构的打开力和∆L直方图（上）；在没有MA的情况下，20A-T结构的打开力和∆L直方图（下）。e，在有和没有MA的情况下不同结构中折叠物种的百分比。
作者认为通过增加T-T错配的数目，可以增加其对于MA的响应以降低检出限。作者利用滚环扩增制备了含有多个T44链段的DNA结构并将其固定在两个处于光阱的微球上（图5a）。加入10 pM的MA在20分钟内即可观察到打开特征（图5b），而加入1 pM时，只有33%的DNA与MA结合（图5c）。通过计算，该方法对MA的检出限低至3pM，几乎比之前的报道降低了1000倍。
图5 使用PolyT模板对MA进行测定。a，由RCA制备的PolyT结构示意图。b，c， 10 pM（b）和1 pM（c）的MA的情况下的展开F–X曲线。
4. 纳米结构组装
为了探索这种PolyT-MA DNA双链体对DNA纳米结构自组装的可能调控作用，作者研究了双交叉（DX）图案的一维组装（图6a-c）。每个DX的每一边都包含一个平末端和一个T10 overhang。在添加10 mM MA时，T10 overhang会相互结合将DX瓦片组装成1D阵列，并通过AFM成像将其可视化（图6b，c）。作者后续扩展了此策略，来调节由3点和4点星基元组成的2D DNA阵列的形成（图6e-i）。与DX基元一样，星形基元的每个分支的外端均包含一个平末端和一个T10 overhang（图6d，g）。在没有MA的情况下，两个基元均保持不变。在添加10 mM MA时，两个图案都组装成2D阵列。
图6 应用PolyT-MA编程DNA纳米结构的自组装。a-c，DNA DX组装为1D的链状结构。d-f，DNA 3PS瓦片组装成六边形2D阵列。g-i，DNA 4PS瓦片组装成四边形2D阵列。ADNLab3. 内容总结与展望
1. 通过PAGE、CD光谱、动态光散射、X射线衍射等手段确认了PolyT与MA的作用模式以及晶体结构。
2. T-MA-T三聚体的分子间作用力超过了A-T碱基对，从而能够以3 pM的灵敏度检测三聚氰胺。
3. PolyT-MA双链体可以发生链置换，而且无需toehold。它还可以应用于DNA纳米技术并且成功组装为2D DNA纳米结构。
利用小分子调节DNA特性的能力扩展了我们对DNA化学的认识，超越了Watson-Crick碱基配对，并提供了一种廉价的替代方法来生成基于DNA的结构。 可以想象的是，其他具有正确氢键能力的小分子可能以类似的方式与其他碱基相互作用。 了解DNA与其他有机分子的相互作用方式可能会为程序化的超分子化学和生物传感中的应用提供机会。
文章链接
DOI：10.1038/s41563-020-0728-2
参考文献
1. Chen, D., Meena, Sharma, S. K. & McLaughlin, L. W. Formation and stability of a Janus-wedge type of DNA triplex. J. Am. Chem. Soc. 126, 70–71 (2004).
2. Zeng, Y., Pratumyot, Y., Piao, X. & Bong, D. Discrete assembly of synthetic peptide–DNA triplex structures from polyvalent melamine–thymine bifacial recognition. J. Am. Chem. Soc. 134, 832–835 (2012).
3. Avakyan, N. et al. Reprogramming the assembly of unmodified DNA with a small molecule. Nat. Chem. 8, 368–376 (2016).
作者
