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加州大学JACS | NRPS中氧化结构域的催化机理-indigoidine生物合成2020-09-26

摘要  非核糖体肽合成酶氧化酶NRPS Ox结构域氧化蛋白结合中间体,能够在具有生物活性的天然产物中安装关键的结构基序。目前针对这一领域的机制仍然难以确定。本文通过对水溶性蓝色素indigoidine合成酶进行研究,证明了Ox结构域利用了活性位点残基酪氨酸665去质子化蛋白结合的L-谷氨酸残基,并且该活性位点残基在NRPS Ox结构域中具有通用性。这一发现不仅阐明了由indigoidine合成酶介导的生物合成路径,而且使人们对于NRPS Ox结构域的结构机理有了进一步了解。

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内容非核糖体肽合成酶NRPSs和某些聚酮合酶PKSs是通过采用硫模板机制合成次级代谢产物的模块化酶。与其他的模板机制相比,硫模板机制在线性延伸阶段具有大量的修饰,从而导致其代谢产物的结构具有多样化。NRPS Ox结构域常将衍生自L-半胱氨酸的噻唑啉氧化为正在延伸的中间体噻唑,所得的噻唑通常在相关的硫模板产物(如埃博霉素、博来霉素、毒素杆菌素等)的生物活性方面起着关键作用(Fig.1a)。然而,由于缺乏对NRPS Ox结构域结构机理的了解,特别是对其生物化学活性位点残基认识的不足,所以阻碍了其工程化的应用。       水溶性蓝色素indigoidine合成酶结构简单,是单模块NRPS,其N-末端腺苷化(A)结构域嵌入了一个Ox结构域,其后是肽基载体蛋白(PCP)结构域和硫酯酶(TE)结构域,是研究NRPS Ox结构域催化机理的理想模型。有趣的是,indigoidine合成酶基因广泛分布于细菌中,常与化合物1的C-5位糖基化酶的基因共定位,控制生成indigoidine、C-核苷类抗生素以及最小霉素minimycin的生物合成(最小霉素minimycin是一类结构简单但具有明显抗菌和抗肿瘤活性的抗生素,但其生物合成机理却一直是困扰科研人员的难题。武汉大学陈文青课题组曾从最小霉素基因簇的克隆入手,揭示了一个非核糖体多肽合成酶负责最小霉素生物合成的起始步骤。与此同时,还意外地发现了该蛋白负责indigoidine的生物合成,从而将indigoidine的生物合成与最小霉素建立起了令人难以想象的联系)。然而针对indigoidine合成酶如何催化生成化合物1,目前还不清楚。关于indigoidine合成酶将产物3转化为1的生源途径,作者推测其有两条。首先是TE结构域催化环化产物3,随后Ox结构域将其氧化成产物1(路径a);或者是产物3先被氧化为产物5,然后再经过环化反应生成产物1(路径b)。通过监测PCP结构域上的酰化变化,作者阐述了indigoidine合成酶生物合成过程,并揭示了NRPS Ox结构域的催化机理(Fig.1b)。

Figure 1. NRPS oxidase (Ox) domain in natural product biosynthesis.为了进一步验证这两条路径,作者首先在大肠杆菌BAP123中纯化了holo-BpsA,然后在ATP 和MgCl2存在的条件下与L-谷氨酰胺一起孵育,此时发现了产物2。紧接着作者将holo-BpsA与外消旋体4一起孵育,结果并未发现产物2。由此表明路径a可能并不用于生产化合物1(Fig.2)。

Figure 2. HPLC-DAD to determine indigoidine production.
为了探究生物合成过程中PCP结构域上酰化的变化,作者接下来采用LC-MS/MS分析了BpsA的体外重组反应,然而并没有检测到任何的酰化变化。由于BpsA能够有效地转化L-谷氨酰胺,所以作者推测这可能是由于中间体的数量低于最低检测限造成的。于是,为了累积足够的中间,作者利用定点突变灭活了TE结构域,得到突变体BpsA TE null。然而,也未检测到与化合物5对应的离子。相反,他们观察到了一种新型的PCP衍生的肽离子。受到氨基酸氧化酶催化反应的启发,作者猜测化合物6是5的水解产物。为了验证水解反应的进行,在BpsA TE null分析中,作者将L-谷氨酰胺替换为L-[氨基-15N]谷氨酰胺和L-[酰胺-15N]谷氨酰胺。结果表明,15N同位素是从L-[酰胺-15N]谷氨酰胺中引入6,其中15N标记的氨基可能被水解。这些数据表明,indigoidine合成酶催化途径为路径b,这其中包括了化合物3至化合物5的氧化过程(Fig.3)。

Figure 3. Assessing acylation changes on the BpsA PCP domain by LC-MS/MS.
紧接着,为了进一步分析观察PCP酰化变化,作者针对BpsA Ox结构域活性位点残基进行了靶向突变,使Ox结构域失活。研究发现,NRPS Ox结构域在活性位点处利用一个碱基残基,使得PCP结合的底物的Cα-H去质子化,从而发生氧化反应。然而,该碱基残基却从未被鉴定出来。于是,作者试图通过解析BpsA Ox结构域来鉴定该碱基残基。在这其中McbC酶引起了作者的关注,它是一种FMN依赖的脱氢酶,参与RiPP催化抗生素微素B17的生物合成,能够将azoline氧化成azole,且与NRPS Ox结构域中的一些局部氨基酸具有序列相似性。这些结果表明,NRPS Ox结构域与McbC具有类似的催化机制,其中McbC是以Tyr202为碱基来夺取azoline中的α-H。将McbC与NRPS Ox结构比对发现,McbC中的Tyr202与BpsA 中的Tyr665相互重叠,其中Tyr侧链指向FMN辅助因子。于是,作者推测BpsA Tyr665可能是活性位点碱基残基(Fig.4a)。

为了验证上述假设,作者将BpsA S1102A (TE null)突变体中的Tyr665变为Phe。该突变体BpsA Y665F S1102A (Ox_TE null)保留了FMN辅助因子,但是其在体外不产生化合物2。在LC/MSMS分析中,几乎没有检测到化合物6的衍生肽离子,相反Ox结构域的底物3得到了累积。与此同时,在野生型BpsA中具有Y665F突变的(BpsA Ox null)突变体中也得到了类似的结果。这些数据表明,Tyr665是BpsA Ox结构域的活性位点碱基残基(Fig.3b)。接下来,作者进一步探究了Tyr作为活性碱基残基在NRPS Ox结构域中的一般性质。氨基酸序列比对分析表明,Tyr在所有的NRPS Ox结构域中都是保守的(Fig.4b)。然后,作者从大肠杆菌BL21(DE3)中纯化了epothilone NRPS 的Ox结构域EpoB-Ox,并合成了methylthiazolinyl-S-NAC(7)。再将EpoB-Ox与methylthiazolinyl-S-NAC(7)进行共孵育,此时得到了产物methylthiazolyl-S-NAC(8)。当将EpoB-Ox Tyr1162变为Phe时,尽管其保留了FMN,但是失去了氧化活性,与煮沸的EpoB-Ox相当。根据结构/序列比对以及生化研究的结果,作者认为NRPS氧化酶与McbC一样,通过类似E2消除机制催化氧化反应。活性位点中的酪氨酸残基作为碱基,从PCP结合的底物中夺取Cα-H上的质子,Cβ-H向FMN中的N5进行进攻(Fig.4)。

Figure 4. Mechanistic insight into NRPS Ox domains.总体而言,作者确定了由indigoidine合成酶介导的特定的生物合成路径,并进一步揭示了NRPS Ox结构域的一般机制。其中NRPS Ox结构域的机制与RiPPs和NRPS中的唑类产物的生物合成相对应。RiPPs生物合成也运用了模板机制,这两种不同的肽天然产物生物合成路径运用了相同的范式,在不同的生物合成阶段安装相似的结构基序。

来源:遇见生物

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