今天和大家分享一篇发表在JACS上的文章，题目是“Selective Modification of Tryptophan Residues in Peptides and Proteins Using a Biomimetic Electron Transfer Process ”，通讯作者是美国怀俄明大学化学系的 Michael T. Taylor教授。
背 景 介 绍在蛋白质上选择性的引入化学分子可以赋予生物分子结构新的性质和功能，从而促进治疗发展和化学生物学的进步。鉴于生物分子结构的多样性以及生物结合在多个学科中日益复杂的应用需求，开发一系列具有互补位点选择和功能的化学生物结合方法仍然是必要的。光化学驱动的生物结合反应，不需要生物正交基团的预先功能化，不但可以实现对反应的时空控制，还可以实现位点选择性。实现生物分子结构的光化学标记主要集中在利用光催化方法实现蛋白质交联以及半胱氨酸、酪氨酸和C-末端的修饰。
作者在此提出一种无催化剂的光生物结合方法，利用天然蛋白质结构固有的光不稳定性来诱导蛋白质标记，此方法与催化技术互补，并且标记条件温和（纯水缓冲液，低[蛋白质]，短的反应时间），在具有类似氧化电位的氨基酸之间可以实现位点选择性。作者注意到色氨酸（Trp）倾向于参与光诱导电子转移（PET），具有最大的天然氨基酸摩尔吸收率和最大的光离子化倾向，并且作为还原性猝灭剂和光化还原剂参与了多种PET蛋白内的反应事件（Figure1A）。
Figure 1.Pyridinium salt reagents for Trp-selective protein modification by mimickingbiological PET. Trp是一个理想的生物结合靶点，因为它是一种稀有的（∼1%天然丰度）氨基酸。因此，任何对Trp有选择性的方法都可以获得具有高精度、结构均一性和具有重现性的蛋白质结构。目前的Trp修饰策略通常依赖于Trp选择性亲电产物的产生，如金属卡宾、氮氧化物、亚磺酰氯、三氟甲基自由基、过渡金属络合物和氧化策略；而利用Trp固有的光不稳定性可以在更为生物相容的条件下实现Trp的功能化。最近，Shi 报道了一种肽的光化学修饰方法，这种肽通过一种独特的光化学介导的烯基化过程修饰 Trp、His 和 C-末端。
作者建议使用N-取代吡啶盐 1 将PET 和 Trp 标记结合到一个过程中（Figure1B）。1 容易被还原，吡啶环上的取代基的变化以及 N-取代基的变化可导致不稳定N-N键的均裂裂解，并产生一种可用于成键反应的新的活性自由基。 作者认为使用Trp作为电子还原剂激活 1 的同时，产生了Trp•+和一个以N为中心的活性自由基，该自由基可以重组，并在Trp处进行选择性修饰产生标记蛋白，（Figure1B），从而避免了通常与Trp光离子化相关的光降解途径。
实 验 结 果
作者选择奥曲肽OAc 2 验证这一假设。奥曲肽·OAc 2 是一种 1 kda的生长抑素类似物，含有D-Trp残基并且已知具有光不稳定性。作者首先用UV-B光在NH4OAc缓冲液中照射 2 和吡啶盐 1a 溶液30分钟（表1，条目1）。
作者选择奥曲肽OAc 2 验证这一假设。奥曲肽·OAc是一种 1kda的生长抑素类似物，含有 D-Trp 残基并且已知具有光不稳定性。作者首先用 UV-B 光在 NH4OAc 缓冲液中照射 2 和吡啶盐 1a 溶液30分钟（表1，条目1）。
作者观察到高转换水平的 2，但只有中等水平转换到标记的肽 2a（34%，entry 1）。进一步的优化最初未能改善这一点，7mM的1a仅27%显示2a的形成（entry2）。在这些情况下，作者注意到不稳定副产物的形成，这些副产物被解释为 2 的光降解。当在1mM谷胱甘肽（GSH）存在下进行反应时，观察到完全转化（>95%）为 2a，单/双标记比率> 20/1（entry3）。
通过LC/MS数据，作者认为GSH通过其作为活性氧（ROS）清除剂的关键生物学功能来增强反应。值得注意的是，在这些条件下，没有观察到GSH与 2、2a或1a 的任何加合物。串联质谱显示Trp是反应中唯一的修饰位点。这些条件还允许在较低浓度下标记 2，当[2]=10 μM时完全转化（entry 4）。接下来，作者探讨了缓冲液在反应中的作用，发现标记反应在 20 mM pH 7.4磷酸盐（entry 5）和 20 mM NaOAc（entry 6）中平稳进行，尽管前者需要稍长的反应时间，并导致较小的单/双标记比率（3:1）。串联质谱显示第二个标签也位于Trp 残基上。最后，没有光照条件的情况下没有反应（entry 7）。1a 显示出极好的水溶性（>100 mM）和稳定性，在pH值为 6.9 NH4OAc 缓冲液、缓冲液（pH值为7.4）GSH 的毫摩尔浓度和人血清中在48小时内分解<10%。作者将这种稳定性归因于 1a 的 2，4 和 6 位置的甲基化，抑制了亲核加成。有了这些条件，接下来探讨 1 将报告基团传递到 2 的能力（Figure 2）。氨基甲酸酯基团 1a 为衍生化提供了一个简单方便的方法，使用这种化学方法可以很容易地得到：脱除保护基团后的 2b、纯化标签 2c 和有linker基团的2d（Figure 2A）。2 的标记也可以在更高的浓度下进行，可以达到毫克级。3.5毫克级规模的1a标记2（[2]=700μM）经高效液相色谱纯化后得到 2a，平均分离产率为 68% 。1c含有一个胺基，可以用于进一步的衍生化。将 1c 与含NHS 酯的炔烃连接，然后进行光化学标记，能够以优异的转化率将炔烃连接到到 2（Figure 2B）。反应混合物的 LC/MS 痕迹表明，标记过程产生单一的反应产物（Figure 2C）。
Figure 2
接下来作者探索了在具有不同拓扑结构和氧化还原/光不稳定残基的肽和蛋白质上标记Trp残基（Figure 3）。Leuporelin 3 是一种1.2 kDa肽，含有 Trp、Tyr 和 His，在 1a 和光照条件下高转化率地提供单一修饰的产物 3a。MS实验证实 Trp 是修饰的唯一位点。3 也适用于3mg规模（[3]=500 μM）的标记，以73 %的平均产率在 Trp 处提供单一的修饰产物 3a。
Figure 3
此外，对抗生素达托霉素4（1.6 kDa，1Trp，1 kynurenine）、蜂毒素5（2.7 kDa1，Trp）和胰高血糖素6（3.4 kDa 1 Trp，1 His，2 Tyr，1 Met，羧基末端）均进行选择性 Trp 标记，转换良好。每种情况下使用的肽浓度根据每种特定肽的溶解度特性而变化，其中 4–6 在浓度 ≥ 100 μM时聚集。
Figure 4接下来作者试图获得对标记过程的初步机械理解，这有助于解释该过程对 Trp 的选择性（Figure 4）。由反应混合物连续暴露于UV-B 光组成的时间控制实验清楚地证明，2a 的形成仅在UV-B光的存在下发生（Figure 4A）。无论是在黑暗中还是在 365 nm的 UV-A 辐射下进行的反应都没有转化。自旋陷阱速度和 NaI 都是 Trp 荧光的高效猝灭剂，并且已知它们与吡啶形成电荷转移中间体，也抑制了反应。大量过量的丁烯醇（可以捕获自由N-中心自由基）对反应没有影响（Figure 4B）。重水中的 5a 在 302 nm光照下 D, L-Trp 的 C 4位置完全氘化，证实了 Trp 的光激发（Figure 4D）。 考虑到 1a 吸收波长不超过 295 nm，作者用 305 nm长通滤光片滤光照射 2 和 1a，反应几乎完全进行，转化率很高，但速度较慢（Figure 4B）。对肽结合物 2a 和 3a 的NMR分析表明，通过C-N键的形成，标记发生在吲哚 C2 位置；未观察到甲基处的偶联（Figure 4D）。综上所述，作者提出 PET 是驱动反应的关键过程（Figure 1B）。Trp的选择性归因于它的 ε 值比 Tyr 大 50 倍。
Figure 5最后，作者研究了溶菌酶 7 的修饰，这是一种光不稳定的14.3 kDa蛋白质，显示6位Trp残基、3位Tr残基和无数其他氧化还原活性残基（Figure 5）。用 1a 标记溶菌酶的同时，作者还观察到 cys 谷胱甘肽化，其可能通过[Trp]*还原近端二硫化物或通过硫基自由基交换产生（Figure 5C）。为了避免这种副反应，作者通过改变标记过程的机制，使Trp→[1]*成为主导途径，使得蛋白质内PET的降解可以最小化。因此合成了苯基取代盐 1d。1d 吸波长红移（λmax=299 nm，1aλmax=272 nm）（Figure 4C）并显示出不可逆还原电位; 与1a的不可逆还原电位相比，阳极移动了近200mv。使用1d，用6:1单/双标记共轭物标记溶菌酶，15分钟转化率大于90%，并且谷胱甘肽化被还原为微量水平（Figure 5D） 在实验中作者发现，使用更高浓度的谷胱甘肽来完全抑制谷胱甘肽化是有益的。由于1d 大于 320 nm具有显著吸收，作者使用 320 nm长通滤波器照射1d和7以抑制Trp激发，在45分钟内的标记溶菌酶顺利转化，转化率为94%（Figure 5E）。在这种情况下，使用较低浓度的 GSH（3 mM），标记反应进行得更快。消化/MS2显示 Trp-62 是氨甲酰化的位点。双标记共轭物的形成量不足以确定第二标记的位置。虽然7的修饰发生在活性部位，修饰后的 7 仍然显示出溶菌活性，这表明氨基甲酸标记和反应条件都不会使蛋白质变性。
结 论作者报道了利用电子响应的N-氨甲酰吡啶盐和 UV-B 光照对肽和小蛋白中色氨酸（Trp）残基进行选择性修饰的光化学过程。初步的机理实验表明，光共轭过程是通过Trp 与吡啶盐之间的光诱导电子转移（PET）进行的，随后N-氨甲酰吡啶盐中N-N键断裂，同时N-氨甲酰基团向 Trp 转移。该反应对 Trp 具有很好的选择性，并且对其他有氧化还原活性的氨基酸残基具有耐受性。此外，该反应在纯水条件下进行，无需有机助溶剂或光催化剂，谷胱甘肽可增强标记信号，多肽浓度在10-700 μM范围内均可高效操作。通过对含 6-Trp 的肽和 1-14 kda 的蛋白质进行标记，探索了该工艺的范围。作者通过将相关的报告手柄转移到 Trp 残基上，并通过调整试剂的性质，使其能够在光不稳定的底物上进行光化学转化，证明了N-氨甲酰吡啶盐的多功能性。
文献整理：Lin Hao
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.0c03039
