高效液相色谱（HPLC）是一种色谱分析技术，用来分离混合物，以确认并量化各个成分的比例。正因为HPLC在化学实验室中应用非常普遍，大家难免遇到这样那样的问题，那么使用HPLC常见的问题有哪些呢？又怎么去解决呢？

作为一种高精密仪器，高效液相色谱仪在使用过程中的操作要注意很多细节，否则就容易出现一些问题。其中最常见的问题就是柱压问题、漂移问题，和峰型异常的问题。

1. 柱压问题

柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在50PSI（3.3 Bar）之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。压力过高、过低都属于柱压问题。

– 压力过高

这是高效液相在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的原因。此时，我们应该分段进行检查。 (1)首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体自由滴下，则溶剂过滤头正常。 如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。处理方法：用30%的硝酸浸泡半个小时，再用超纯水冲洗干净。 (2)打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力降至100PSI (6.7 Bar)以下，则过滤白头正常。 如果压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。处理方法：将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。 (3)把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。处理方法：如果是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。这时，如果柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以尽量少用。

– 压力过低

压力过低的现象一般是由于系统泄漏，处理方法：寻找各个接口处，特别是色谱柱两端的接口，把泄漏的地方旋紧即可。当然还有一个原因就是泵里进了空气，但此时表现的往往是压力不稳，忽高忽低，更严重一点会导致泵无法吸上液体。处理方法：打开Purge阀，用3~5ml/min的流速冲洗，如果不行，则要用专用针筒在排空阀处借住外力将气泡吸出。

2. 漂移问题

主要包括基线漂移和保留时间漂移。

– 基线漂移

一般说来，机器刚起动时，基线容易漂移，大概要半个小时的平衡时间，如果你用了缓冲溶液或缓冲盐，还有就是在低波长下（220nm）平衡时间相对会比较长，但如果你在实验过程中发现基线漂移，则你要考虑下面的原因：

（1）柱温波动。即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。 解决方法：控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱。

（2）流通池被污染或有气体。 解决方法：用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池（最好断开柱子）。如有需要，可以用1N的硝酸（不要用盐酸）。

（3）紫外灯能量不足。解决方法：更换新的紫外灯

（4）流动相污染、变质或由低品质溶剂配成。解决方法：检查流动相的组成，使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂。

（5）样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。解决方法：使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。

（6）检测器没有设定在最大吸收波长处。解决方法：将波长调整至最大吸收波长处。

（7）流动相的PH值没有调节好。解决方法：加适量的酸或碱调至最佳PH值

（8）使用循环溶剂，但检测器未调整。解决办法：重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相。

（9）柱平衡慢，特别是流动相发生变化时。解决办法：用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。

（10）流动相配比不当或流速变化。解决办法：更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。

（11）检测器出口阻塞（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线）。解决办法：取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。

（12）流动相不均匀（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移）。解决办法：使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气。

– 保留时间漂移

保留时间重现是液相性能好坏的一个重要标志，同一种东西，两次的保留时间相差不要超过15s，超过了半分钟可看做保留时间漂移，就无法进行定性，你要考虑以下原因：

（1）温控不当。解决方法：调好柱温，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱。

（2）流动相比例变化。解决方法：检查四元泵的比例阀是否有故障。

（3）色谱柱没有平衡。解决方法：在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱 。

（4）流速变化。解决方法：重新设定流速。

（5）泵中有气泡。解决方法：从泵中除去气泡 。

3. 峰型异常问题

峰型问题是液相的主要问题，在做液相过程中，我们就是要变换不同的条件来改善不好的峰型，对于各种各样的异常峰，要区别对待，从主要问题出发，逐个加以解决。针对各种情况的成因作相应调整即可。 （1）色谱图中未出峰。原因：系统未进样或样品分解；泵未输液或流动相使用不正确；检测器设置不正确。

（2）一个峰或几个峰是负峰。原因：流动相吸收本底高；进样过程中进入空气；样品组分的吸收低于流动相。

（3）所有峰均为负峰。原因：信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒；光学装置尚未达到平衡。

（4）所有峰均为宽峰。原因：系统未达到平衡；溶解样品的溶剂极性比流动相差很多；色谱柱尺寸及类型选择不正确；色谱柱或保护柱被污染或柱效降低；温度变化造成的影响；流动相组成变化；流动相粘度过高流速太低；样品体积过大；检测器时间常数过大；检测池体积过大；保留时间太长；柱外体积过大；样品过载等。

（5）所出峰比预想的小。原因：样品黏度过大；进样品故障或进样体积误差；检测器设置不正确．定量环体积不正确；检测池污染；检测器灯出现问题。

（6）出现双峰或肩峰。原因：进样量过大；样品浓度过高；保护柱或色谱柱柱头堵塞；保护拄或色谱柱污染或失效；柱塌陷或形成短通道。

（7）前伸峰。原因：进样量或样品浓度高；溶解样品的溶剂较流动相极性强；保护柱或色谱柱污染或失效。

（8）拖尾峰。原因及解决办法：柱超载，降低样品量或增加柱直径采用较高容量的固定相；峰干扰，对样品进行清洁过滤或调整流动相；硅羟基作用，加入三乙胺，用碱致钝化柱，增加缓冲液或盐的浓度，降低流动相pH值；柱内烧结不锈钢失效，更换烧结不锈钢，加在线过滤器，对样品进行过滤；死体积或柱外体积过大，将连接点降至最低, 尽可能使用内径较细的连接管；柱效下降，更换柱子, 采用保护柱，对柱子进行再生。

（9）出现平头峰。原因：检测器设置不正确；进样体积太大或样品浓度太高。

（10）出现鬼峰。原因及解决办法：进样阀残余峰，在每次进完样后用充足的时间来平衡和清洗系统；样品中存在未知物，改进样品的预处理；流动相污染，更换新流动相，尽可能现配现用，隔夜的流动相再次使用时要过滤；尽可能使用HPLC级试剂；流路中有小的气泡，打开Purge阀，加大流速排除。

另外，还有一些用户的经验总结如下：

色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同;另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。

1、样品的前处理：

– 最好使用流动相溶解样品。

– 使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。

– 使用0.45µm的过滤膜过滤除去微粒杂质。

2、流动相的配制： 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：

– 流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。 – 流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。

– 流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果;同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。

– 流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。

– 流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。

– 在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。

3、流动相流速的选择： 因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml/min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml/min为佳。 当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。