J. Am. Chem. Soc.：从组合生物杂交核酸碱基肽库中发现核酸结合分子

引言

核酸（RNA和DNA）靶向治疗受到了研究者们的广泛关注，其靶向途径涵盖了从小分子到大于100 kDa的复合大分子（CRISPR-Cas）范围的所有分子。核酸作为治疗目标，主要原因在于特定基因的突变、转录活性的失调和非编码RNA（ncRNA）是许多遗传和获得性病理学的核心。即像肽又像核酸的合成非生物聚合物是靶向核酸的一种有趣形式。这些聚合物应具有对特定寡核苷酸的高亲和力和选择性。由于氨基酸侧链允许其具有高度多样化的结构和功能，而核酸碱基可以通过碱基配对与核酸相互作用，因此多年来科学家希望生产出二合一的生物材料。尽管科学家在这类二合一生物材料方面做出许多努力，到目前为止还没有针对混合肽生物杂交的可靠高通量选择/解码策略的报道。

成果简介

近日，麻省理工学院的Bradley L. Pentelute在《J. Am. Chem. Soc .》期刊上发表了题为“Discovery of Nucleic Acid Binding Molecules from Combinatorial Biohybrid Nucleobase Peptide Libraries”的研究论文。在该研究中，作者描述了生物杂交核碱基肽的有效合成和从头测序程序的发展，通过将蛋白质氨基酸和核碱基与单一低分子量精密聚酰胺聚合物结合在一起，建立了有效的化学合成和从头测序程序，并准备了具有多达1亿个生物杂交分子的组合文库。与仅由规范氨基酸组成的肽相比，这种生物杂交材料对寡核苷酸的堆积亲和力更高。使用亲和力选择质谱，作者发现了与前体microRNA发夹具有高度亲和力的变体。该平台为高通量筛选靶向特定寡核苷酸链聚合物提供了有前途的途径。

图文解读

图1、生物杂合序列聚合物的最新实例。（A）在David Liu实验室开发的高度功能化的核酸。这些结构可以通过PCR扩增并测序，因此可用于适体选择。（B）Heemstra课题组开发的改良PNA。通过疏水性和亲水性侧链驱动PNA自组装成超分子结构，保留对RNA的序列特异性结合。（C）本文工作：开发了用于核酸碱基肽的有效合成和测序策略，从而可以从组合文库中开展筛选实验。

方案1、（A）合成十二种核酸碱基氨基酸单体。（B）通过Fmoc固相肽合成（SPPS）将核酸碱基氨基酸单体掺入肽中。由于聚酰胺具有化学稳定性，可通过SPPS高效组装。且Fmoc保护的氨基酸是可商购的，并且已有文献中已经报道了几种与SPPS相容的展示碱基的氨基酸单体。因此选择具有基于α-氨基酸的单体的聚酰胺肽主链来合成生物杂交核碱基肽文库。首先重点研究基于α-氨基酸的结构单元。这些单体可使序列特异性的聚合物具有识别二级结构的潜力，并适合采用针对典型肽段和蛋白质组学优化的MS / MS方法和算法进行从头测序。首先合成了十二个核碱基氨基酸单体。为了在覆盖广阔的化学空间的同时确定合成的可及性和测序兼容性，制备了具有不同接头的三个单体组，这些接头将四个核碱基中的每一个与氨基酸部分相连（1A）。通过与各自的核碱基的亲核开环将丝氨酸内酯转化为丙氨酰核碱基单体，核碱基与丙氨酰支架之间的连接基为亚甲基。通过用相应的核碱基对溴进行亲核取代，将溴高丙氨酸转化为高丙氨酰基（hAla）核碱基单体。将二氨基丁酸（Dab）与核碱基乙酸衍生物偶联，提供带有乙基酰胺基甲基接头的Dab-核碱基单体。随后将12个核碱基单体有效地掺入具有氨基酸结构单元的短肽中（1B），通过LC-MS测定，这12种粗核碱基肽的纯度为70％至99％。

图2、使用串联MS / MS和测序软件，从头确定了每个化合物具有多达四个核碱基的核碱基肽的从头序列。（A）分别合成三个核碱基单体（蓝色：丙氨酰基；紫色：高丙氨酰基；绿色：Dab）和规范氨基酸残基的三个组合文库，并通过纳米 LC-MS / MS分析。使用软件PEAKS 8.5进行从头测序，并筛选最终列表以寻找正确文库设计的序列。右侧柱状图为鉴定的总序列和含有不同数量核碱基的序列的百分比。使用非天然聚合物进行筛选实验需要高保真从头测序。通过专注于拥有约200个成员的组合文库建立了从头测序程序。首先在三个不同的文库中分析了丙氨酰基，高丙氨酰基和Dab核碱基单体，以确定每个接头对测序的影响。文库设计12345678K，其中1、3、6和8是两个规范氨基酸之一，而2、4、5和7是规范氨基酸或四个核碱基单体之一。每个文库的总多样性为2⁸ =256。每个文库包含具有一个核碱基的64个序列，具有两个核碱基的96个序列，具有三个核碱基的64个序列和具有四个核碱基的16个序列。实验表明> 70％的核碱基肽均可通过从头MS / MS测序进行序列鉴定。（B）三个文库中核酸碱基的MS/MS谱图，右侧显示了碱基侧链的片段。显示肽主链片段化以及核碱基和核碱基-乙酰基（Dab文库）解离。在丙氨酰文库中观察到最突出的核碱基解离，可能解释了其较低的序列识别率。

图3、具有多达1亿个生物杂交分子的组合文库。（A）分别表示单体集和生物杂交核碱基肽或规范肽的1亿个成员文库的示意图。（B）根据所使用单体的百分比计算文库中每个序列的碱基数。测序实验的结果表明，所有三组核苷碱基单体均可用于文库合成和测序。随后准备了一个组合库，格式为X₉K，每个可变位置使用12个核碱基单体和18个规范氨基酸。将固定的Lys残基置于C端，以促进MS / MS测序，所有y型离子上均带恒定电荷。单珠化合物（OBOC）拆分和合并合成用于制备具有约10⁸个成员的文库（3A），该大小适合基于磁珠的亲和力选择。该文库的大小是高多样性（增加识别结合物的可能性）与每个文库成员的足够浓度以确保用于亲和力选择和后续MS / MS测序的材料（每个化合物约10 fmol）的足够浓度之间的折衷。为了控制每个序列的核碱基数量，对分池合并过程进行了偏置：在每个偶联步骤中，将20％的树脂用于12个核碱基肽，而80％的树脂用于规范残基。基于此，文库分布表明86％的序列将具有1-4个核碱基（显示了高可信度测序），11％的无核碱基和3％的5个或更多核碱基（3B）。

图4、杂合核碱基肽相较于标准肽对寡核苷酸具有更高的亲和力。（A）ELISA测定法示意图：将固定的核碱基肽库或规范肽库分别与生物素化的DNA库一起孵育。（B）ELISA结果图：核碱基肽对DNA的亲和力高于规范肽。将具有相同格式（X₉K，1亿成员）的核碱基肽库和规范肽库固定在ELISA（酶联免疫吸附测定）板上，并与生物素化DNA库（Biotin-N₂₀，N：腺嘌呤，胞嘧啶，胍或胸苷）。另外，固定带正电的肽38（LKKLLKLLKKWLKLKLK），以探测静电相互作用。暴露于与链霉亲和素（SA）和四甲基联苯胺（TMB）偶联的辣根过氧化物酶（HRP）后缔合。与规范肽库和带正电的肽相比，核碱基肽库显示出明显更高的信号，表明核碱基肽文库是鉴定核酸结合物的优选库。

图5、通过亲和力选择鉴定对RNA发夹具有纳摩尔亲和力的核碱基肽。（A）基于磁珠的亲和力选择的示意图（红色：链霉亲和素包被的磁珠；棕色：生物素化的前miRNA）。（B）通过亲和力选择鉴定序列的ETD谱。（C）选定序列的结构。（D）用于将前体质量提取的离子计数;（E）前体miRNA-21与固定化的39-生物素的BLI结合/解离。（F）前体miRNA-155与固定的39-生物素的BLI结合/解离。（G）39和与RNA和DNA寡核苷酸结合的衍生物的汇总表。由于细胞中的基因表达受miRNA控制，而miRNA与疾病相关，因此前miRNA发夹的靶向备受关注。与结构化发夹前体miRNA的结合可能会抑制加工成成熟的活性miRNA。本文选择与疾病有关的两个前体miRNA是前体miRNA-21和前体miRNA-155。设想核碱基肽库可用于发现高亲和力的前体miRNA-发夹结合物。将生物素化的前体miRNA（21和155）固定在抗生蛋白链菌素磁珠上，并与1亿成员核碱基肽文库（5A）孵育。用测序软件PEAKS 8.5可视化所得的MS光谱，并使用Python脚本进一步完善，该脚本指定了与库设计匹配的变体。最后，为每个变体创建提取的离子色谱图（基于PEAKS用于测序的前体离子）：仅将在色谱图中产生清晰峰的化合物视为“选定”（5D）。在对照色谱图中对相同离子进行交叉分析（仅对珠子进行分析）可以排除潜在的非特异性珠子或链霉亲和素结合剂。在这些步骤之后，为了富集前体miRNA21，仅鉴定了一种核碱基肽：Lys-DabG-hAlaA-Arg-Asp-DabA-Leu-hAlaG-Ala-Lys（5B，C）。在前体miRNA-155富集的LCMS色谱图中鉴定出了变异离子，在未修饰的对照样品中不存在（5D）。为了验证选定序列与前体miRNA发夹的结合，合成了具有C端生物素手柄（39-生物素）的化合物。将39生物素固定在生物层干涉术（BLI）链霉亲和素尖端上，并确定溶液中前体miRNA21在不同浓度下的缔合/解离：发现前体miRNA21的解离常数（K_d）为9 nM（4E）和前体miRNA-155的12 nM（4F）。而对缺少发夹环的前体miRNA-21茎的亲和力降低了50倍以上，表明发夹环对于结合39的重要性。且选定的核碱基肽与RNA发夹的结合比DNA发夹，单链DNA（ssDNA）和双链DNA（dsDNA）更具选择性。为了研究核碱基单体和单个残基在选定序列中的作用，合成了几种类似物。首先，将4个核碱基单体突变为丙氨酸，色氨酸或谷氨酰胺。这些变体显示出对前体miRNA21的结合亲和力降低（> 50-100倍降低；5G）。接下来，通过对每个位置进行丙氨酸扫描，发现N端赖氨酸和4位精氨酸的突变消除了结合，而对所有其他位置的单突变耐受，并且不会显着影响其与前体miR21的结合（5G）。

总结与展望

非生物合成聚合物是功能性材料或治疗药物开发的新形式。在这项工作中，作者展示了SPPS对核碱基单体的设计和合成。强大的合成程序可以制备数百万个组合文库，并且与标准肽相比，这类材料对核酸的亲和力增强。本文构建的平台显示了高通量发现序列特异性合成非生物聚合物的可能性，这些聚合物具有有利于寡核苷酸结合的特性。作者还建立了生物杂交核碱基肽聚合物的合成和测序程序，每个序列最多包含十个残基和四个核碱基。综上所述，本研究突出了合成组合文库与现代质谱相结合的潜力，可用于探索新的化学空间和发现配体。作者设想通过继续进入化学空间领域将为发现具有新颖功能，特性甚至酶活性的材料创造机会。

文献链接

DOI: 10.1021/jacs.0c08964

https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jacs.0c08964

作者简介

Bradley L. Pentelute，麻省理工学院教授。

研究兴趣：主要目标是发明新的化学方法来修饰自然界中的蛋白质，从而增强其对人类医学的治疗性能；还致力于将大生物分子传递到细胞质中。

作者主页：http://pentelutelabmit.com/