PNAS | 利用内吞体 IP 和溶酶体 IP 对神经元内溶酶体蛋白质组进行分析

分享一篇最近发表在 PNAS 上的文章，本文的题目是“Endo-IP and lyso-IP toolkit for endolysosomal profiling of human-induced neurons”。本文的核心是在人来源的神经元上实现了溶酶体 lysosome 和内吞体 endosome 的富集，并进行了蛋白质组学。本文的通讯作者是来自哈佛医学院细胞生物学系的 J. Wade Harper。

人的基因组中有约三分之一的基因编码了含有跨膜结构域的蛋白，而绝大部分细胞膜定位蛋白的丰度是由内溶酶体系统（endolysosomal system）借助细胞内吞作用（endocytosis）所控制的。这些被内吞体所捕获的蛋白，要么被重新运送回细胞膜，要么被定位到高尔基体，或运送到溶酶体内被降解。

高度极化的细胞，比如神经元细胞，它们高度地依赖内溶酶体系统来调控轴突和树突的分化，以及突触结构的区室化。如果神经元的内吞作用过程受损，则会引起很严重的神经退行性疾病，比如帕金森病和老年痴呆症。然而，目前我们对神经元细胞中究竟哪些蛋白参与和调控了这一过程，缺乏一个系统且完整的认知。

本文作者们为了对神经元细胞中参与内吞作用途径的两个关键细胞器，内吞体和溶酶体，其蛋白质组进行全面的刻画，研究人员们将之前课题组开发的内吞体免疫沉淀富集 endo-IP（Park et al., nature communications, 2022. doi: 10.1038/s41467-022-33881-x）策略，即将早期内吞体抗原 EEA1 与 3× FLAG 融合表达，通过病毒感染的方式，让细胞稳定表达该蛋白，细胞裂解后就可以通过 anti-FLAG beads 将早期内吞体富集纯化出来。不过，本文是直接借助CRISPR-Cas9 技术，在人的胚胎干细胞的基因组上，直接在 EEA1 基因编辑加入了 3× FLAG 的序列。另外，为了同时富集溶酶体，作者们也借助之前开发的溶酶体免疫沉淀富集策略，将特异定位在溶酶体表面的蛋白 TMEM192 与 3×HA 融合表达，将细胞膜破碎后，通过 anti-HA beads 就可以对溶酶体实现富集（doi: 10.1126/science.aan6298）。作者们在之前已经构建好的内源 Lyso-IP 的人胚胎干细胞上，进一步对其编辑，使该细胞即可以用来溶酶体富集，又可以实现早期内吞体富集。

作者们首先诱导人胚胎干细胞分化成神经元细胞，分别进行两种细胞器富集和蛋白质组学，并证明了其策略的可靠性，如溶酶体 IP 组中富集到绝大部分蛋白都已知定位在溶酶体。作者们随后探究了胚胎干细胞分化成神经元细胞的过程中，在第1、2、4、6、8、10 和 12 天的时候，这些细胞内吞体上的蛋白质组是如何动态变化的。最后，作者们对数据进行分析，总结了这些内溶酶体都属于哪些复合体，位于突触的哪些位置等等。

总之，本文首次实现在人的神经元上对内吞体细胞器的蛋白质组进行了详细的刻画和分析。

本文作者：LZH

责任编辑：FTY

文章链接：

https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2419079121

原文引用：DOI：10.1073/pnas.2419079121