推荐一篇发表在Nat. Chem. Biol.上的论文，题目为“Engineering covalent small molecule–RNA complexes in living cells”，通讯作者是因斯布鲁克医科大学的Alexandra Lusser教授和因斯布鲁克大学的Ronald Micura 教授， Lusser教授致力于染色质组装与重塑领域的研究，Ronald Micura 教授的研究方向是RNA的化学修饰。
在RNA研究中，理解RNA的功能和动态行为对揭示生物过程至关重要。在精确标记和追踪RNA动态方面，传统的非共价标记方法存在一定的局限性。尽管已有基于探针的技术用于识别反应性RNA，这些方法反应慢、效能差，或依赖光激活；并且，现有的技术通常依赖蛋白酶或复杂反应，难以普适应用。因此，开发不依赖蛋白酶的小分子共价标记技术，成为提高RNA研究精度和应用潜力的关键挑战。在这项研究中，作者探索了一种基于结构引导的方法，通过将配体修饰为具有亲电基团，使其能够与RNA结合位点的鸟嘌呤发生反应，从而将小分子配体共价连接到其对应的RNA靶标上。
作者首先在已充分表征的preQ1 I型核糖开关（preQ1-I）上开展研究。preQ1-I具有特定的配体结合口袋，作者对该结合口袋进行了详细评估，发现7-氨基甲基-7-脱氮嘌呤的氨基甲基基团适合通过一个短链（三个碳原子长）的手柄进行亲电衍生化，这一衍生化可以使其与鸟嘌呤-5（G5）的N7发生亲核反应。作者选择短小的3-溴丙基手柄，非常适合与N7-G5亲核体发生SN2反应；同时，核酸碱基类似物的配体衍生物通过氢键相互作用，进一步增强了与RNA的结合。因此，作者合成了配体Brc3DPQ1，与preQ1 RNA在接近生理条件下孵育时，获得了大量的RNA加合物，并通过优化条件进一步提高了反应产率。接下来，作者通过高分辨质谱确认了在核酸上的修饰位点为G5核苷。接下来，作者通过一系列实验对连接子长度、离去基团的种类、反应的位点以及不同类型RNA结构进行测试，揭示了烷基化反应的关键因素。通过这些实验，作者深入了解了影响preQ1核糖开关烷基化反应的多个因素，并为优化反应条件和提高反应效率提供了理论依据。
荧光激活适配体(FLAPs)已经发展成为可对活细胞中的RNA进行成像的一种高效工具。但目前开发的FLAPs系统，它们的荧光分子与适配体是以非共价方式结合的，容易被洗脱导致荧光信号丧失，因此，作者开发了一类新的共价FLAP系统。作者选择了Pepper适配体，能够识别类似于绿色荧光蛋白的染料分子HBC，通过三维结构分析，作者发现Pepper适配体的结合口袋可以与HBC的反应性手柄发生化学反应，并设计出了一种3-溴丙基修饰的衍生物Brc3HBC。进一步的优化通过将溴化物换成甲磺酸酯（MsOc3HBC），提高了溶解度并进一步增强了反应速率和产率。此外，作者还生成了带有第二个功能基团的Pepper配体，用于生物正交化学反应，从而pull-down目标RNA的相互作用组。
作者设计了两个质粒用于在人类293T细胞中表达这些适配体，并通过转染和配体处理，实现了适配体与配体的稳定共价结合。接下来，作者通过实验表明，MsOc3HBC配体能够稳定地与Pepper适配体共价结合，并且在细胞内保持较高的信号强度，克服了非共价配体在细胞洗涤过程中的信号丧失问题。进一步的超分辨率显微镜成像表明，Pepper RNA在核斑点周围形成明确且动态的结构，表明该系统能可靠地跟踪RNA在细胞内的运动，而不受配体交换的影响。
总之，该研究提出了一种共价连接RNA适配体与小分子配体的新方法，增强了细胞成像和RNA动力学研究的稳定性与灵敏度，并可应用于RNA富集与药物靶向，推动了RNA药物开发。
本文作者：ZJ
责任编辑：WYQ
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41589-024-01801-3
文章引用：10.1038/s41589-024-01801-3
