分享一篇近期发表在Journal of the American Chemical Society上的文章，题为：A Functional Assay for Mining Noninhibitory Enzyme Ligands from One Bead One Compound Libraries: Application to E3 Ubiquitin Ligases。该文章的通讯作者为来自The Herbert Wertheim UF Scripps Institute for Biomedical Innovation & Technology的Thomas Kodadek教授。
化学二聚体作为能够使两种或两种以上不相关的蛋白质接近的合成分子，在化学生物学和药物开发中具有重要价值。化学二聚体的一个重要应用为将靶蛋白引入某种酶的附近，而这种酶能够改变靶蛋白的活性，如PROTAC，此类应用的核心在于二聚体分子需结合酶但不抑制其活性。然而，目前主流的高通量筛选（HTS）方法无法区分非抑制性结合分子和未结合分子；而其他筛选方式虽可以找到配体，却无法直接反映其对酶功能的影响，这其中就包括一珠一化合物库（OBOC）。
本文中作者开发了一种新型功能筛选平台：通过在TentaGel（TG）树脂上共固定酶底物与小分子，并在近乎无背景“反式”修饰的条件下引入可溶性酶。若小分子与酶结合则会使酶在固定化底物附近形成高浓度，从而驱动底物发生翻译后修饰（PTM），进而通过荧光标记等方法检测，从而实现结合与酶活性的同步检测。本文成功将该技术应用于E3泛素连接酶配体的挖掘中。如图1所示。
图1. 从一珠一化合物库中筛选非抑制酶配体的方法
作者首先建立了一种基于邻近驱动的树脂上泛素化检测方法，用于筛选VHL E3泛素连接酶的非抑制性配体。作者制成了六种不同的TG珠，分别固定了VHL配体VH 032（阳性对照）或乙酰基（阴性对照），并连接了1或2或3个赖氨酸残基作为简化底物。利用这6中TG珠与酶共孵育后，通过Alexa Fluor 647标记的抗泛素抗体染色和流式细胞术分析，发现展示VH 032的TG珠显示出显著高于对照组的泛素依赖性荧光信号，且赖氨酸数量对信号强度影响不大，证明这一检测方法能够有效区分VHL配体与非结合物，并证实被招募至TG珠的酶复合物可介导多次泛素化事件形成泛素链。如图2所示。作者进一步替换掉此前使用的赖氨酸简化底物进一步考察了蛋白底物在树脂上的泛素化效果，结果显示VH 032组的TG珠呈现显著高于对照组的泛素依赖性荧光信号。如图3所示。
图2. 利用简化底物建立VHL E3连接酶配体的活性偶联分析
图3. 利用蛋白质底物建立VHL E3连接酶配体的活性偶联分析
接下来作者比较了VHL配体VH 032与PROTAC分子MZ1的树脂在介导底物泛素化效率上的差异。在标准酶浓度下，两者均可支持HTP-BRD4bd2的泛素化，但MZ1 珠信号更强。随着酶浓度稀释，两类树脂的荧光信号均减弱；在最低浓度时，MZ1珠仍保持显著高于背景的泛素化信号，而VH 032 珠则与阴性对照组无区别。这表明PROTAC凭借其同时结合E3泛素连接酶与底物的能力及由此产生的额外蛋白互作自由能，在低酶浓度下仍高效驱动泛素化。说明可通过调节酶浓度灵活控制筛选严格度，从而优先发现PROTAC类分子，而非简单的E3配体。如图4所示。
图4. VHL E3连接酶配体和PROTAC介导的蛋白泛素化程度比较
作者又将所建立的功能性筛选平台应用于Cereblon E3连接酶复合物，以验证其在不同E3连接酶体系中的适用性。如图5所示。
图5. HTP-BRD4bd2-His6在树脂上的泛素化
最后作者利用所建立的筛选平台，通过平行固相合成构建了一个具有92种含羟脯氨酸化合物的微孔板OBOC库，用于发现新型VHL配体。经过泛素化反应和流式细胞术分析，发现4个化合物能介导底物蛋白的多聚泛素化，其中化合物8活性较强且分子量较小，将其与BRD4配体JQ1连接形成PROTAC分子WJ3014，可在1 μM浓度下使HeLa细胞中BRD4水平降至对照的23%，其降解作用可被VH 032或游离JQ1竞争抑制。竞争结合实验证明化合物8是VHL的弱结合配体，验证了该功能筛选策略在发现弱活性非抑制性配体方面的有效性。如图6所示。
图6. 利用树脂上泛素化实验发现一种新的VHL配体
综上所述，本文开发了一种基于OBOC库的功能性筛选平台，通过将小分子与酶的结合与酶活性结合，特异性地识别非抑制性酶配体。作者成功将其应用于VHL和Cereblon等E3连接酶配体的发现，并鉴定出新型弱结合VHL配体化合物“8”，其衍生的PROTAC分子可介导细胞中靶蛋白降解。该策略可推广至其他蛋白质翻译后修饰酶的非抑制性配体发现，且通过调节酶浓度可有偏好地进行筛选。
作者：YXM
DOI: 10.1021/jacs.5c07307
Link: https://doi.org/10.1021/jacs.5c07307
