分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Mass Spectrometry of Proteins and Protein Complexes Electrosprayed in the Presence of Common Biological Buffers Using Theta Emitters1,文章的通讯作者为普渡大学化学系的Scott A. McLuckey教授。
金属离子与生物分子的相互作用对生命过程至关重要，但生理浓度下的非挥发性盐（如150 mM NaCl）会严重干扰天然电喷雾质谱(Native ESI-MS)，带来抢夺电荷、增加化学噪声、加合峰展宽甚至完全抑制蛋白信号等负面影响，故常规流程必须先进行除盐操作。透析、换液等脱盐步骤既损失样品，又可能破坏蛋白构象与相互作用。本文中，作者使用内径约1.4 μm的theta喷针(θ)在生理缓冲液中进行蛋白质Native ESI-MS分析。θ喷针是一种带有隔膜的玻璃喷针，将喷针分为两个通道，允许在喷针两侧快速混合溶液。一侧进含1×PBS等生物缓冲液的高盐样品，另一侧进200 mM醋酸铵(AmAc)，两级气相碰撞(BTCID＋DDC)有助于在线剥离盐加合物。电喷雾时在尖端形成一个Taylor锥，两股液体到达锥尖的时间、速度略有差异，因此不完全混合使Taylor锥内产生少量“低盐微滴”，足以形成清晰电荷态，从而无需脱盐即可在生理盐浓度下准确测定14-466 kDa蛋白及复合物的质量。
作者首先设置了三组对照（θ喷针+醋酸铵除盐、θ喷针+高盐缓冲液、常规喷针+盐浓度减半），考察θ喷针对未除盐的高盐缓冲液中蛋白和复合物(溶菌酶Lyz、亲和素AvT和β-半乳糖苷酶β-Gal)的Native ESI-MS检测效果。结果表明，θ喷针+醋酸铵组三种蛋白均获得清晰、高强度的多电荷谱图(图1 a, d, g)。当换成生理盐缓冲液也就是不进行除盐操作时，θ喷针仍可分辨出Lyz +5至+8、AvT四聚体+15至+18及β-Gal +48至+54等电荷态(图1 b, e, h)，只是绝对强度下降10-100倍且伴随盐簇背景。而使用常规单通道喷针在相近甚至更低离子强度下几乎看不到蛋白信号，谱图被化学噪声和盐加合物掩盖(图1 c, f, i)。这说明在高盐生理环境中使用θ喷针获取可用于质量计算的电荷态是可行的。
图1.正离子模式下采集的代表性nano-ESI谱图：(a)溶解在100 mM AmAc中的Lyz(5 μM), (b)溶解在150 mM NaCl加20 mM HEPES中的Lyz(5 μM), (c)溶解在200 mM AmAc、75 mM NaCl和10 mM HEPES中, 使用单通道喷针的Lyz(5 μM), (d)AvT(1 μM)溶解在175mM AmAc中, (e)AvT(1 μM)溶解在150 mM NaCl加20 mM HEPES中, (f)AvT(1 μM)溶解在200 mM AmAc、75 mM NaCl加10 mM HEPES中，使用常规单通道喷针, (g)β-Gal (4 μM)溶解在100 mM AmAc中, (h)β-Gal(4 μM)溶解在140 mM NaCl加10 mM HEPES中，以及(i)β-Gal(4 μM)溶解在200 mM AmAc、70 mM NaCl加5 mM HEPES中。
同样地，作者为了检验θ喷针能否在更严苛的Tris-HCl缓冲体系中重复高盐耐受能力，设置了图1相同的三组对照。结果显示，θ喷针+醋酸铵组依旧获得高信噪比的谱图(图2 a, d, g)；当把蛋白溶于150 mM NaCl/25 mM Tris-HCl并用θ喷针一侧补充200 mM AmAc时，三种蛋白的特征电荷态仍能被分辨，只是强度再降18-90倍且盐簇噪声更高(图2 b, e, h)；而将盐浓度砍半并用常规单通道喷针时，谱图几乎被化学背景淹没，蛋白信号几近消失。作者还采用了相同的方法考察了θ喷针在最常用、盐负荷最高的PBS缓冲体系中不除盐的质谱检测效果，现象与其他缓冲液一致。进一步拓展了θ喷针在真实缓冲环境中进行原生质谱分析的适用性。
图2.在正离子模式下采集的代表性nano-ESI谱图：(a)溶解在100 mM AmAc中的Lyz(5 μM), (b)溶解在150 mM NaCl和25 mM Tris-HCl中的Lyz(5 μM), (c)溶解在200 mM AmAc、75 mM NaCl和 12.5 mM Tris-HCl水溶液中的Lyz(5 μM)，(d)AvT(1 μM)溶解在175mM AmAc中，(e)AvT(1 μM)溶解在150 mM NaCl 加25 mM Tris-HCl 中，（f）AvT(1 μM)溶解在200 mM AmAc、75 mM NaCl加12.5 mM Tris-HCl中，(g)β-Gal(4 μM)溶解在100 mM AmAc 中，(h)β-Gal(4 μM)溶解在150 mM NaCl加25 mM Tris-HCl 中，以及(i)β-Gal(4 μM)溶解在200 mM AmAc、75 mM NaCl加12.5 mM Tris-HCl中。
随后，作者为了厘清θ喷针改善高盐信号的真正原因——究竟是液滴变小、稀释作用，还是AmAc的即时化学去盐效应，设计了θ喷针双通道分别喷PBS+PBS、PBS+AmAc、PBS+空白、AmAc+空白四组实验。以Lyz为例，结果显示，当两侧都喷PBS时谱图与单通道喷针无异，蛋白信号极低(图3 b)；若仅在单侧喷PBS而另一侧空置，虽可见电荷态但强度仍较弱(图3 d)；一旦在另一侧加入200 mM AmAc，即使总体离子强度几乎不变，蛋白电荷包络立即变得清晰可辨，强度显著回升(图3 f)。这一现象说明θ喷针的优势并非单纯靠“液滴尺寸”或“物理稀释”，而是AmAc在Taylor锥内与PBS发生瞬时、不完全混合，局部降低Na+强度，从而在线削弱盐加合，使少量“低盐微滴”足以产生可检测的干净蛋白离子，进一步支持了“不完全混合-局部去盐”是θ喷针能在生理缓冲液中实现免脱盐原生质谱的核心机制。
图3.溶解在(a, c, e)150 mM Amac和(b, d, f)1×PBS中的5 μM Lyz的代表性nESI质谱。（a, c, d)中θ喷针的另一侧没有加载溶液。
最后，作者通过Lyz及其配体结合实验：“单通道喷针预先混匀”、“θ两侧均AmAc”和“θ分通道引入蛋白与配体”三种方式，考察θ喷针内两股液流是否能在毫秒级的Taylor锥寿命里达到结合平衡。 结果显示，单通道预混时复合物相对丰度为17.0 %(图4 a)；当蛋白与配体分别走两通道但均在AmAc环境中，比例降至14.1 %(图4 b)；若两通道分别引入纯蛋白和纯配体溶液，复合物信号骤降至2.2 %(图4 c)，显著低于平衡值。由此说明：θ喷针内的混合远未达到热力学平衡，两流在锥内停留时间过短、空间分离明显，导致绝大多数液滴来不及完成结合反应。这一“非平衡”特性正是其能产生“局部低盐微滴”并实现在线去盐的根本原因，只有恰好富含AmAc而NaCl含量少的少数微滴把蛋白干净地送进气相，才导致在高盐缓冲液中也能记录到可解析的电荷态，为θ策略提供了微观动力学依据。
图4.使用θ喷针时Taylor锥体中混合不完全的证据，结合分数显示出统计学上的显著差异。
总的来说，本文针对生理浓度非挥发性盐严重干扰Native ESI-MS的瓶颈，提出以1.4 μm的θ喷针为核心、辅以两级气相碰撞的免除盐策略。双通道毛细管一侧引入含150 mM NaCl的PBS/HEPES/Tris真实缓冲液，另一侧仅通200 mM醋酸铵，利用Taylor锥内毫秒级、不完全混合产生的“低盐微滴”统计效应，使少量蛋白分子避开盐加合，在线剥离Na+后形成清晰电荷态，成功测得14-466 kDa范围内溶菌酶、亲和素及β-半乳糖苷酶四聚体的质量，误差<1%。该方法无需透析、柱换液等繁琐除盐步骤，样品损失小，且采用常规口径毛细管，操作与标准nano-ESI兼容，为生理环境下蛋白复合物结构研究提供了简便、低损耗的新路径。同时，该方法也存在一些潜在风险：信号强度比无盐体系下降10-300倍，低丰度复合物检测仍受限；θ尖端拉制参数、对位角度和流速差异导致谱图重现性波动大；混合非平衡虽利于去盐，却使弱相互作用定量偏离真实平衡值；此外，体系尚只能处理≤150 mM NaCl的缓冲液，在更高离子强度或复杂基质中的普适性仍需验证。
撰稿：陈凤平
编辑：李惠琳
文章引用：Mass Spectrometry of Proteins and Protein Complexes Electrosprayed in the Presence of Common Biological Buffers Using Theta Emitters
