分享一篇发表在ACS Chem. Biol.上的文章：“Bioorthogonal Metabolic Labeling of the Virulence Factor Phenolic Glycolipid in Mycobacteria”，其通讯作者是2022年诺贝尔化学奖得主、斯坦福大学教授Carolyn Bertozzi，她的研究兴趣主要是利用化学生物学手段研究细胞表面糖。在本文中，作者利用生物正交代谢标记策略使分枝杆菌中毒性因子酚糖脂可视化，并对其丰度、空间分布和动态学行为进行了描述，这将有助于对分枝杆菌致病机制的研究。
结核杆菌（M. tuberculosis）是结核病的病原体，是导致细菌感染死亡的主要原因。它具有独特的富含脂质的细胞被膜（图1a），而该结构在毒力中发挥重要作用。酚糖脂（PGL）存在于菌膜最外层，是决定膜脂毒力的主要成分（图1b）。海分枝杆菌（M. marinum）也能产生PGL，但其糖链结构与结核杆菌的有所不同（图1c），而且这两种PGL的免疫调节作用也具有种属依赖性。基于PGL在寄主-病原关系中的重要作用，作者报道了一种代谢标记策略来对活分枝杆菌细胞中PGL进行成像，并解析其在分枝杆菌细胞中的分布和动力学。
结核分枝杆菌PGL的生物合成是一个复杂的多步骤过程（图2）。作者注意到起始原料对羟基苯甲酸（pHB）可以用叠氮基团修饰成关键中间体，后被分枝杆菌细胞吸收并代谢性结合到细胞表面PGL中。
因此，作者合成了2-和3-叠氮- pHB，用图示工作流程测试他们对细胞表面PGL的代谢标记能力（图3a）。当用2-叠氮- pHB标记M. marinum时，与空白对照组相比其平均荧光强度（MFI）没有增加，而用3-叠氮- pHB标记M. marinum时，可明显观察到MFI显著且呈剂量依赖性增加（图3b）。另外，通过A600测量发现2-和3-叠氮- pHB都不会明显影响细胞的生长（图3c）。基于以上实验结果，作者选择使用3-叠氮- pHB作为后续研究的代谢标记底物。为了确定MFI是由3-叠氮- pHB标记细胞表面脂质引起的，作者用3-叠氮- pHB和AF647DBCO标记M. marinum，并通过TLC分离，结果发现提取物中的主要荧光物质的Rf与用带电荧光染料修饰的脂质一致（图3d）。随后，作者使用共聚焦显微镜确定标记的M. marinum中荧光的位置，发现主要集中在PGL所在细胞外膜上，且与DMSO对照相比，细胞形态没有明显差异，这表明叠氮化物代谢标记PGL对M. marinum细胞的宏观结构没有显著影响（图3e）。
图3. 用3-叠氮-pHB处理M.marinum的荧光标记
为了证实3-叠氮- pHB标记到PGL中，作者使用HPLC-Q-TOF-MS分析M. marinum脂质提取物，并结合碰撞诱导离解质谱（CIDMS）验证其数据，结果证明3-叠氮- pHB代谢性结合到PGL中（图4a-c）。随后，作者通过流式细胞术量化了不同浓度3-叠氮- pHB对PGL-N3丰度的影响，发现750μM时表现出最大MFI，并通过MS测量了3-叠氮- pHB对PGL和PGL-N3总产量的影响，结果证实MMFI与PGL-N3丰度是相关的（图4d-e）。
图4. 用3-叠氮-pHB标记M.marinum脂质的MS分析
接下来，为了证实3-叠氮- pHB主要标记PGL，作者使用PFL缺陷的分枝杆菌进行了类似的实验，发现3-叠氮- pHB和AF647-DBCO标记M.marinum突变体脂质时，TLC未检测到荧光物质（图5a-c）。为了进一步测试3-叠氮-pHB标记的选择性，作者先后进行了使用天然pHB进行的竞争实验和热杀方式消除标记，以验证3-叠氮- pHB的代谢标记仅发生在具有完整PGL生物合成途径的活菌中（图5d-e）。
图5. 3-叠氮-pHB的代谢标记仅发生在具有完整PGL生物合成途径的活菌中
随后，作者用不同浓度的3-叠氮-pHB标记结核分枝杆菌HN878，发现与DMSO对照相比MFI明显增加，而且细菌生长受到3-叠氮-pHB标记的显著影响。另外，3-叠氮-pHB标记PGL缺陷的突变结核分枝杆菌菌株HN878Δpks15/1和天然PGL缺陷Erdman菌株时，TLC结果显示两者均无标记，这证实了该底物对PGL的高度特异性。（图6）
图6. 3-叠氮-pHB对结核分枝杆菌HN878的代谢标记
最后，作者通过光漂白后荧光回收（FRAP）实验来研究PGL的膜动力学，结果发现对照组TMM-488的τ1/2为~10s，PGL-488的τ1/2为3s，表明PGL具有比TMM更强的膜流动性（图7）。
图7. FRAP实验证明PGL具有比TMM更强的膜流动性
总之，作者开发了一种叠氮化PGL前体，可代谢标记到天然M.marinum的PGL中，通过MS对PGL-N3进行表征，证明该前体对产生PGL的分枝杆菌具有选择性，并使用该成像工具描绘了菌膜内的PGL动力学。
文章作者：YX
DOI: 10.1021/acschembio.3c00724
