分享一篇发表在ADVANCED MATERIALS上的文章，题目为“Multivalent Nanobody Conjugate with Rigid, Reactive Oxygen Species Scavenging Scaffold for Multi-Target Therapy of Alzheimer’s Disease”。 长期以来，人们一直认为阿尔茨海默病(AD)的诱导和进展与大脑中淀粉样蛋白-β肽(Aβ)的聚集有关, 在过去的几十年里，许多治疗策略都集中在抑制Aβ的异常聚集或消除过量的Aβ聚集。更重要的是，越来越多的研究表明，由于AD的发病机制复杂，单Aβ靶向治疗不足。因此，同时靶向Aβ和其他生物标志物的有效治疗策略成为对抗AD复杂发病机制的有力工具。

高水平的ROS可引起神经元氧化损伤，促进Aβ沉积，最终导致突触丧失氧化应激还介导小胶质细胞激活分泌促炎细胞因子，损害小胶质细胞吞噬Aβ斑块的能力，加剧阿尔茨海默病的进展。因此，氧化应激被认为是AD治疗的重要靶点。由于纳米体或单域抗体序列可编程性、构象特异性和通过其互补决定区(CDR)的强抗原结合亲和力，使其成为靶向淀粉样蛋白并进一步阻止其聚集的令人注目的候选物。

将Aβ1-42片段(33-GLMVGGVVIA-42)接到亲本纳米体的第三个CDR (CDR3)中，可以产生一个工程纳米体(NB)，通过同型相互作用靶向和抑制Aβ聚集。NB可以进一步与163-171人白细胞介素(IL)-1β (VQGEESNDK)进行基因工程，这是一种免疫刺激肽，不含炎症和热原效应，创造纳米体NBIL。这种纳米体工程不仅有望识别淀粉样蛋白并抑制其聚集，而且还应增强小胶质细胞对Aβ聚集物的吞噬。

作者开发了一种具有刚性骨架的水溶性共轭聚合物聚(deca-4,6-diynedioic acid) (PDDA)。作者使用PDDA作为支架连接多个NBIL，由于PDDA的多价效应和刚性骨架，所获得的PDDA-NBIL偶联物(PNBIL)将进一步显著增强NBIL与Aβ聚集体的结合亲和力。

   PNBIL与Aβ聚集体之间的超高效结合激发了作者对PNBIL是否对Aβ聚集有很强的抑制作用的研究。硫黄素-T（ThT）是一种常用的小染料分子，通过插入淀粉样蛋白的β-片来探测淀粉样蛋白聚集体的形成，而不影响淀粉样蛋白形成的动力学。ThT检测监测的Aβ聚集动力学表明NB和NBIL都能抑制淀粉样蛋白聚集，PNBIL组在整个实验过程中没有可检测到的荧光强度变化。接下来，作者继续研究PNBIL是否能有效保护神经元免受Aβ诱导的细胞毒性。首先评估了NB、NBIL和PNBIL的生物相容性，结果表明这些纳米体衍生物在生物应用方面是安全的。接下来，作者将SH-SY5Y细胞与Aβ、NB、NBIL或PNBIL在Aβ:纳米体摩尔比为10:1的条件下孵育24小时。与对照组相比，Aβ单独可以显著降低细胞活力至75%左右，证实了Aβ聚集过程的神经毒性。当NB或NBIL存在时，细胞存活率提高到90%。然而，PNBIL的存在可以将细胞活力恢复到100%，这表明PNBIL具有保护神经元免受Aβ聚集引发的毒性和损伤的特殊能力。

作者继续评估PDDA是否能赋予PNBIL长期清除AD病变中ROS的能力。当与Aβ共孵育时，HMC3细胞的细胞活力下降到约70%，DCF（活性氧荧光探针）荧光增加到近400%，证明Aβ聚集可引起相当大的氧化应激和对HMC3细胞的细胞毒性。当NB或NBIL与Aβ同时存在时，细胞活力增加到85%左右，PNBIL可使细胞活力恢复100%，并将ROS水平降低至与对照组相同。从荧光图像上看，经Aβ和PNBIL处理的HMC3细胞的DCF荧光也明显比其他组暗，进一步验证了PNBIL抑制细胞内ROS水平的能力.

接下来，作者通过流式细胞术记录细胞内Cy5标记的Aβ聚集体(Cy5-Aβ)的荧光强度，研究了PNBIL对小胶质细胞吞噬和Aβ聚集体降解的影响，这是大脑Aβ聚集体清除的主要途径。与NBIL相比，PNBIL导致细胞内Cy5-Aβ的MFI增加了近两倍，这表明PNBIL通过多价效应和ROS消除极大地促进了Aβ聚集体的小胶质吞噬。在所有组中,Cy5-Aβ和PNBIL孵育的HMC3细胞图像显示细胞内Cy5荧光信号最高，与溶酶体共定位，表明PNBIL能有效促进溶酶体介导的Aβ聚集体的小胶质吞噬。接下来，将HMC3细胞与Cy5-Aβ和不同纳米体衍生物共孵育0.5小时后洗涤，并在新鲜培养基中再培养24小时。PNBIL处理的HMC3细胞在孵育24小时后Cy5荧光减少最多，表明小胶质细胞中Aβ聚集体的有效降解。这些结果共同说明PNBIL可以通过促进小胶质细胞吞噬和降解过程来促进Aβ聚集物的清除。

在体外验证了PNBIL的各种功能后，最后作者评估它们是否可以降低小鼠大脑中Aβ负荷水平，以及Aβ聚集引发的病理特征。Aβ:PNBIL组小鼠在目标象限的游泳时间更长，通过隐藏平台的Aβ沉积物和低聚物水平也更低，表明Aβ负担在小鼠脑中有效减少。为了了解PNBIL对体内氧化应激的影响，我们还使用ROS探针双氢乙醚(DHE)测量了脑微环境中的ROS水平。Aβ:PNBIL组小鼠的红色荧光明显弱于对照组，表明PNBIL在体内具有较强的清除ROS的能力。

总之，作者报道了一种多价纳米体结合刚性ROS清除支架用于AD多靶点治疗的发展。利用刚性PDDA作为共轭支架，增强纳米体缀合物的多价效应，使NBIL与Aβ聚集体的结合亲和力提高两个数量级，从而实现对Aβ聚集体的超高效抑制。此外，由于PDDA支架独特的结构，PNBIL具有长效清除ROS的作用，因此PNBIL在体外和体内均能有效抑制Aβ聚集，促进Aβ吞噬，降低ROS水平和炎症反应。

本文作者：ZQ

责任编辑：LRC

DOI: 10.1002/adma.202210879

原文链接：https://doi.org/10.1002/adma.202210879