推荐一篇发表在Angewandte Chemie International Edition上的文章,文章标题是“Cyclopropenes as Chemical Reporters for Dual Bioorthogonal and Orthogonal Metabolic Labeling of DNA”。其通讯作者是卡尔斯鲁厄理工学院的 Hans-Achim Wagenknecht 教授,致力于核酸化学、化学光催化、荧光DNA和RNA、DNA结构学。
在先前的研究中,作者已经成功地利用1-甲基环丙烯修饰的DNA通过IEDDA反应实现了标记。于是,作者希望在之前研究的基础上实现DNA的双重生物正交标记。之前的研究表明,甲基环丙烯的反应性会随着甲基取代基的位置而改变,例如1-甲基环丙烯是应用于IEDDA反应的理想候选物,而3-甲基环丙烯的甲基基团会在IEDDA反应的过渡态中造成空间位阻,但却可以与四唑原位产生的腈亚胺发生光点击反应(图1A)。基于这一理论,作者设计了一系列含有1-甲基环丙烯/3-甲基环丙烯的探针(图1B),希望能够通过IEDDA反应和光点击反应实现DNA的双重生物正交标记(图1C)。
B:1-甲基环丙烯修饰的脱氧核糖核苷(1-5)用于IEDDA反应,3-甲基环丙烯修饰的脱氧核糖核苷(6-7)用于光点击反应
C:结合IEDDA反应和光点击反应对DNA进行双重生物正交标记
B:用HPLC来分析探针1和6的正交反应性
C:b)、c)分别对应于修饰有Cy5的引物P1、成功进行IEDDA反应的寡核苷酸的凝胶内荧光成像,d)两者凝胶内荧光成像的Merge
D:对应于修饰有ATTO 390的引物P2的凝胶内荧光成像
最后作者开始尝试在细胞水平上将探针1和6掺入到DNA上实现双重正交标记。首先通过设计细胞毒性试验来确定后续代谢标记中使用的探针浓度,通过MTT实验可知探针1和6的适宜浓度均为0.1 mM。接下来作者的想法是将探针1和6分别进行代谢标记,将各自代谢标记的实验条件摸索清楚后,然后再继续将两探针同时进行代谢标记来实现两者的正交标记。在将探针1进行代谢标记的实验中,作者最初将细胞与探针1孵育48 h后用染料11进行标记,但并未观察到染色后的DNA,这可能是由于探针1的代谢效率低或1-甲基环丙烯在染色质结构中的不可及性。随后作者尝试了两种实验方案的改进(① 在使用染料标记前用盐酸盐溶液对DNA进行变性,②针对细胞内核苷酸代谢途径中将脱氧核糖核苷转变为相对应的脱氧核糖核苷三磷酸较为关键,通过添加合成的核苷三磷酸转运蛋白(SNPP)和探针10来提高代谢通量),结果细胞在探针10与SNTT的共同孵育下最后成功观察到了标记的DNA(图4A)。接着在尝试探针6的代谢标记实验中,作者将细胞与探针6孵育48 h后用盐酸盐溶液变性,接着与溶在乙腈中的染料13孵育1 h,然后在 405 nm下照射20分钟,结果表明探针6可以利用光点击反应进行代谢标记(图4B)。
B:HeLa细胞在经过脱氧核糖核苷酸6的代谢标记后,与染料13发生光点击反应后的激光共聚焦显微成像
作者在摸索清楚各自代谢标记的实验方案后,开始在体内DNA水平上实现两者的双重正交标记(图5A),HeLa细胞与100 μM的探针6一同孵育48 h,随后在含有10 μM的10和10 μM的SNTT的溶液中孵育10 min,随后在培养基中孵育2小时后固定细胞。接着将细胞与1 μM的染料14(染料11的发射波长与染料13有重叠)过夜处理进行IEDDA反应。然后, DNA经盐酸盐溶液变性处理,接着将细胞与含有染料13(30 μM)的乙腈共同孵育,在405 nm下对细胞进行照射,以诱导光点击标记。结果在两个发射波长下,细胞核中存在没有完全重叠的荧光(图5B),这表明作者成功对基因组DNA进行双重正交标记。
B:在优化后的实验条件下,在Hela细胞经过脱氧核糖核苷三磷酸10和脱氧核糖核苷酸6的双重代谢标记后的激光共聚焦显微成像
本文作者:WJ
原文引用:https://doi.org/10.1002/anie.202403044