尽管如此，现有生物催化体系尚未见直接构建硅手性中心的成功案例。相关研究表明，许多含硅有机物（如α-硅醇类结构）在水溶液中稳定性较低，容易发生分解及消旋化。为了突破这一限制并填补领域空白，本课题开发了基于P450氧化酶的去对称化生物催化平台。通过蛋白质工程改造获得的突变体，其酶活较野生型提高了54倍，可在短时间内完成硅烷底物的选择性氧化，从而有效规避产物分解与消旋化问题。
近日，北京生命科学研究所 / 清华大学生物医学交叉研究院刘臻课题组与浙江工业大学杨云芳团队合作，首次实现了含硅手性中心（Si-stereogenic center）硅醇的酶催化合成。研究人员通过六轮定向进化获得了优势突变体ASOx-6，其催化效率（kcat/KM）较野生型P450提升54倍，可高效催化潜手性二氢硅烷的单氧化反应，获得相应的手性硅醇产物。该平台兼容多种芳基-烷基取代底物（包括含芳杂环的硅烷），模版底物的总催化转化数（TTN）可达1,450。
在研究的起始阶段，作者首先对于一系列碳氢键羟化酶的硅烷氧化活性进行了筛选评估。实验表明，P450氧化酶对于这一目标反应不仅具有显著的初始活性以及中等的手性选择性，更为重要的是，该催化体系中未检测到二氢硅烷过度氧化的副产物硅烷二醇3a的生成。基于这一发现，研究人员随后利用野生型P450酶作为母体，进行了多轮的定向进化。通过针对多个活性位点的定点饱和突变（site-saturation mutagenesis）以及随机突变（random mutagenesis），作者最终找到了催化这一反应的高活性突变体ASOx-6。在仅使用0.56‰酶载量的条件下，其催化模型底物的效果为81%的收率以及90%的ee值。
随后，研究人员对于该酶催化系统的底物适用性进行了系统评估。实验表明，多种芳基-烷基取代的二氢硅烷化合物可以被 ASOx-6选择性氧化。底物的兼容性包括芳环上不同位置与电性的取代基，或者部分含有杂环的化合物。针对部分中等收率或者较低选择性的底物，作者并未展开单独的定向进化，但指出基于蛋白质工程经验，可以通过类似的进化策略获得针对性的突变体。
此外，放大反应验证了该体系的合成潜力：分离的手性硅醇产物经由铂催化的硅氢化反应，可立体专一性转化为具有生物活性的硅醇衍生物4a以及4b。
通过DFT计算，作者发现这一催化过程遵循与经典碳氢键氧化体系相似的机制，包括氢原子攫取（Hydrogen-atom abstraction）以及氧回弹（Oxygen-rebound）等关键反应步骤。计算及竞争性KIE实验确认了氢原子攫取为反应的产物决定步骤，然而由于硅氢键的键能显著低于普通的碳氢键键能，在这一硅烷氧化体系中，该步骤并非反应的决速步。分子动力学模拟对比显示：野生型P450BM3与最终变体ASOx-6的近攻击（near-attack）构象中，底物的pro-R氢原子均保持与铁氧中间体较近的距离，而关键突变使pro-S氢在突变体中与氧中心的平均距离增加。这一变化直接决定了最终变体对于该反应更优的对映选择性。
Zhen Liu, Shuang-Yu Dai, Xiahe Chen, Yun-Fang Yang
本项目的实验部分主要由刘臻实验室研究生代双玉完成，计算部分主要由浙江工业大学的陈侠荷博士完成。刘臻研究员和杨云芳研究员为本文的通讯作者。
Angewandte Chemie International Edition
DOI: 10.1002/anie.202501524
