Angew. Chem.：利用硒原子精准“干预”碱基错配识别，实现DNA连接酶特异性千倍提升

DNA连接酶等核酸相关酶对碱基错配的精准识别，是维持生命遗传物质稳定性的基石，在DNA复制、修复、基因合成及分子诊断等领域扮演着至关重要的角色。这些酶通过感知错配碱基对引起的DNA结构扭曲来实现高保真性。然而，传统DNA连接酶对错配的识别能力有限，尤其对远离连接切口的错配不敏感，这极大地限制了其在长片段多片段基因精准合成、高灵敏度核酸检测等前沿生物技术中的应用。此外，其识别错配的原子层面精细机制仍有待深入探索，而这受限于缺乏可精准探测分子相互作用的“原子探针”工具。

近日，四川大学生命科学学院黄震教授、胡贝副研究员团队在 Angewandte Chemie International Edition 上发表研究论文，报道了一种创新的“硒原子探针”策略。他们通过在DNA连接酶的辅因子ATP的α-磷酸上用一个硒（Se）原子替换一个非桥接氧（O）原子，构建了ATP的类似物ATPαSe。研究发现，这个看似微小的“原子突变”极大地增强了DNA连接酶对碱基错配的敏感性，使其连接特异性提升高达1000倍，并将错配识别区域从切口邻近位点拓展至上下游各4个核苷酸（共8 nt），并且对多种碱基错配类型均可以达到较好的识别效果。

机理研究表明，特异性的提升源于Se原子削弱了酶活性中心的关键相互作用，导致错配底物的催化速率（k_cat）显著降低。更重要的是，该策略在实际应用中展现出巨大潜力：在多片段基因合成金门组装（Golden Gate）中，将组装效率提升超过200倍；在单核苷酸多态性（SNP）检测中，成功抑制了背景信号，实现了检测的高准确性。这项工作不仅为研究核酸-蛋白质相互作用提供了全新的原子精度工具，也为开发高保真、高效率的基因组装和分子诊断技术开辟了新路径。

图1. ATPαSe增强DNA连接酶错配识别的原理与效果

研究团队提出了核心假设：在ATP的α-磷酸引入Se原子（形成ATPαSe），会扰动DNA连接酶催化过程中的关键相互作用。当底物DNA存在错配时，这种扰动效应会被放大，从而抑制错配连接，而对正常匹配连接影响较小，最终实现特异性的提升。实验结果证实，与天然ATP相比，ATPαSe显著抑制了切口附近（-4至+4位点）的错配连接反应。

图2. ATPαSe对不同类型错配的歧视能力及动力学分析

通过对不同位点（+1, -1, +2, -2）和不同类型（如G:T, C:A等）的错-配进行动力学分析，结果显示ATPαSe能够普适性地、大幅度地降低错配连接的反应速率（k_obs）。定量分析表明，相较于ATP，ATPαSe可将连接酶的特异性（正确连接速率/错误连接速率）提升最高达1000倍。

图3. 高通量测序验证ATPαSe的普适性

为了验证该策略在复杂序列背景下的通用性，研究人员构建了一个包含大量不同4碱基粘性末端的底物库，并利用二代测序（NGS）技术对连接产物进行分析。结果表明，在高达93%的序列组合中，ATPαSe均能有效提升连接的保真度，证明了该方法的广泛适用性。

图4 & 5. 揭示特异性增强的分子机理

动力学研究（图4）显示，ATPαSe对错配底物的催化速率常数（k_cat）的抑制作用远大于对正确底物，这是特异性提升的主要来源。通过对连接酶活性位点关键氨基酸（K367）进行突变，并结合结构模拟分析（图5），研究团队进一步阐明了Se原子通过干扰活性中心关键氢键网络，从而在原子层面调控酶催化活性的精细机制。

图6. ATPαSe在生物技术中的应用

该策略的实用价值在两大应用场景中得到验证。

（1）高保真基因合成：在极具挑战性的多片段（9片段和15片段）GFP基因的金门组装中，使用ATPαSe的阳性克隆率（组装成功率）比使用ATP时提升了超过200倍，解决了基因合成中的错配难题。

（2）高特异性SNP检测：在多重连接探针扩增技术（MLPA）中，ATPαSe能够有效抑制由野生型模板引起的背景信号干扰，实现了对6种不同SNP突变的精准、无背景的“真阳性”检测，展示了其在精准医疗领域的应用前景。

论文信息

Probing and Enhancing DNA Ligase Specificity via Se-Atom-Mutagenesis of ATP for Accurate Gene Synthesis and Detection

Dejin Xu, Bei Hu, Xiaoling Ding, Tong Qin, Ting Li, Jiaxin Li, Danyan Luo, Lu Chen, Yunfan Xu, Jun Zhang, Han Kang, Yang Zhang, Prof. Zhen Huang

Angewandte Chemie International Edition

DOI: 10.1002/anie.202424948