Angew. Chem. ：固相合成与光裂解策略加速“基于细胞表型筛选的蛋白降解剂发现（PPDD）

诱导蛋白降解作为一种新兴药物作用模式备受关注。其核心是发展能与细胞蛋白结合并招募E3泛素连接酶的双功能化合物（如分子胶和PROTAC），利用细胞自身的泛素-蛋白酶体系统特异性降解目标蛋白，实现对靶标蛋白功能的全面抑制，并在靶向传统“难成药”靶点方面展现出巨大潜力。目前，蛋白降解剂的发现策略主要有基于靶点和基于表型两种。基于靶点的方法是当前的主流，但通常依赖于对目标蛋白结构及其配体信息的掌握；相比之下，基于表型的蛋白降解剂发现（PPDD）通过评估化合物对细胞表型的影响来筛选苗头分子。因其不受靶点先验知识的限制，PPDD策略在针对缺乏已知结合配体或结构信息不明确的“难药靶蛋白”时，具有特殊优势。然而，PPDD的实施仍面临一些挑战：一方面，现有化合物库在多样性与合成效率上难以充分满足其需求；另一方面，在表型筛选（尤其是直接生物学筛选，D2B）中，精确区分由蛋白降解驱动的表型与非特异性效应仍有难度。

近日，浙江大学药学院的朱成梁、曹戟、何俏军团队开发并验证了一种集成双功能分子固相平行合成与D2B筛选的PPDD平台（图1）。这项研究为基于“诱导蛋白降解联合表型筛选”策略的蛋白降解药物研发提供了一种实用途径。

图1. 固相合成与D2B筛选的集成化PPDD平台

该团队运用光裂解连接子和多样化的固相合成策略，实现了化学多样性高、无需复杂纯化即可直接用于表型筛选的双功能分子库的快速构建。在利用改进的固相Ugi四组分反应（Ugi-4CR）高效构建分子骨架的过程中，研究人员设计了两种互补的固相合成路线：其一，采用模块化的两步法构建PROTAC分子，即先在固相载体上合成“光裂解连接子-E3连接酶配体”中间体，随后偶联不同的候选“弹头”分子（具有与细胞蛋白结合潜力的片段）。这种策略分离了弹头分子的引入步骤，从而可以使用结构更为复杂的优势片段，并丰富了连接基团的化学空间。其二，通过单步Ugi反应直接合成潜在的IMiD衍生分子胶（MGD）。两种路线均使用4-甲氧基-2-硝基苯甲醛（MNBA）作为光敏醛组分，使得最终产物在简单的洗涤后，通过特定波长的紫外光照射即可从固相载体上释放，显著简化了纯化过程，非常适合用于D2B筛选。

作为该平台的概念验证，研究团队首先合成了包含21个靶向BRD4蛋白的PROTAC分子库。通过在E3泛素连接酶CRBN野生型（WT）和CRBN敲除（KO）细胞中进行平行的细胞活力筛选，并结合HiBiT技术直接检测BRD4蛋白水平，结果显示，多个PROTAC分子所诱导的CRBN依赖性细胞增殖抑制表型与BRD4降解活性之间存在强相关性，这为该平台应用于蛋白降解驱动的表型研究提供了有力支持（图2）。

图2. 固相合成的BRD4 PROTAC在MDA-MB-231细胞中的生物活性评价

随后，研究团队利用此平台构建了一个包含109个靶向CRBN的双功能分子库（44个MGDs和65个PROTACs）。通过在MDA-MB-231乳腺癌细胞（CRBN WT及CRBN KO）中进行D2B表型筛选，鉴定出数个具有CRBN依赖性生长抑制活性的苗头化合物（图3）。其中，化合物B56因具有较强的CRBN依赖的表型被选中进行后续优化。通过对连接子进行优化，研究获得了效价较B56提升14倍的化合物12-60。进一步的多组学分析和机制验证实验表明，12-60通过招募CRBN，特异性地诱导翻译终止因子GSPT1的降解，进而抑制肿瘤细胞增殖。作为一种结构新颖的GSPT1降解剂，12-60在细胞水平的抗增殖活性及诱导GSPT1降解的最大效果（D_max）与进入临床研究的GSPT1降解剂CC-90009水平相近。这一系列研究结果表明，该平台在无需预知靶点的前提下，通过表型筛选发现新型蛋白降解剂方面具有实用价值。

图3. 靶向CRBN的双功能化合物库构建、D2B表型筛选与苗头降解剂发现

总的来说，该研究开发的这一集成化PPDD平台，通过将高效的固相平行合成与可靠的D2B筛选流程进行有效整合，为表型筛选驱动的蛋白降解剂发现提供了一个实用且高效的解决方案。尽管本文主要聚焦于CRBN介导的蛋白降解和基于细胞活力的表型分析，但其核心方法具有较好的扩展性，有望支持构建靶向其他E3连接酶的多样化双功能化合物库，和用于不同类型的细胞表型评估。此外，该流程具备实现自动化的潜力，为开展高通量合成、筛选和探索更广阔的可降解蛋白质空间奠定了基础。

论文信息

Solid-Phase Parallel Synthesis of Photocleavable Bifunctional Molecules Enables Efficient Phenotypic Protein Degrader Discovery

Baoli Ding, Jiawen Hu, Rongtian Zhang, Binyan Shou, Mengdie Chen, Dr. Li Jiang, Dr. Meng Yuan, Prof. Bo Yang, Prof. Qiaojun He, Prof. Ji Cao, Prof. Cheng-Liang Zhu

Angewandte Chemie International Edition

DOI: 10.1002/anie.202424118