Angew. Chem. ：用于单细胞生物正交标记的光交联光点击反应：七元硫杂环偶氮苯二氧化物作光开关分子

环张力预加载的亲偶极体或双烯亲体，例如，反式环辛烯（TCO），环辛炔衍生物（BCN），作为报告基在生物正交化学领域中扮演着至关重要的角色，它们能够高效地促进多种相互不干扰的精准生物正交共价偶联。然而，这些高环张力分子在活体内的长期持久性一直是一个亟待攻克的难题，因为在生物递送过程中环张力一旦被释放，就不易再次进行加载。为了应对这一挑战，将光能原位转化为环张力能成为了一种极具潜力的解决方案，这不仅能够确保报告基在光激发前的长时间生物稳定性，还能赋予其光控的时空特性。

近日，四川大学化学学院余志鹏教授团队在生物正交光点击化学领域取得了重要进展。他们巧妙地融合了两条独立且激发波长不同的光化学反应途径：一方面，成功实现了悉尼酮光解重排生成腈亚胺（NI）1,3-偶极体（λ₁）；另一方面，实现了七元硫杂环偶氮苯二氧化物（DBTDD）的Z-异构体向高环张力的E-异构体的光开关调控（λ₂），从而原位生成了瞬态高环张力的活性亲偶极体。基于协同作用，团队开创性地开发出一种双波长交叉激活的光点击反应系统。该系统利用光能原位加速反应进程，不仅实现了高时空分辨率的生物正交修饰，还避免了传统生物正交反应中环张力分子在活体环境中稳定性不足的问题。通过这一创新策略，团队成功实现了人工磷脂分子在活体细胞膜上的微米级精准修饰，为细胞膜的动态研究提供了新方法。

图1. 细胞膜上双波长相交光控制的光点击反应概念图

表1. T型光开关的关键光化学和热力学参数

作者首先对一系列DBTDD的光开关性能进行了全面评估。与七元硫杂环偶氮苯（DBTD）相比，光致生成的亚稳态E-构型DBTDD具有更快的热力学弛豫速率，因此成为一种适用于高灵敏响应的T型光开关分子（表1）。这使得DBTDD能够在生物正交化学反应中实现时空可控的环张力加载，提高时空精准度。此外，DBTDD能够与悉尼酮光解产生的腈亚胺偶极体迅速发生超快的偶联反应（图2），生成扭曲的大环产物1cb。与经典的亲偶极体（如sTCO和BCN-OH）相比，DBTDD在与悉尼酮进行光点击反应时产生的副产物显著减少，从而展现出更加卓越的光点击反应性能（图2）。在生物兼容性测试中，DBTDD在含有10 mM谷胱甘肽的溶剂环境中表现出比DBTD和BCN-OH更出色的稳定性。这一特性对于生物正交化学反应尤为重要，因为它确保了DBTDD在复杂的生物环境中能够保存其光开关性质。

图2. a）单芳基悉尼酮的光点击反应以及主要的副反应：图中标记了以橙色表示主要的副产物和以紫色表示的期望环加成产物，以及用于筛选的单芳基悉尼酮库；b) 1cb的单晶结构，结构以50%的概率水平展示；c) 通过HPLC-MS分析光点击反应后产物的分布的直方图。

在探索单个活细胞和亚细胞膜生物正交标记的过程中，作者利用双芳基悉尼酮（DASyd）与DBTDD之间的光点击反应进行研究。实验结果显示，无论是单独使用405 nm激光来激活DASyd，还是仅依赖445 nm激光诱导DBTDD的光异构环张力原位加载，均无法实现人工磷脂分子在细胞膜上的有效生物正交荧光标记，这表明单一波长的光激发无法充分驱动反应体系的协同偶联。唯有同时且空间交叉的两种波长的激光刺激，才能实现共价标记，从而实现精确的生物分子跟踪（图3a-e）。相比之下，DBTD在仅接受405 nm激光照射时，便能在细胞膜上实现荧光标记，无法达成双波长的高维度光控。

通过对比分析，作者发现DBTDD修饰的磷脂分子（DBTDD-PL）在双波长同步光照射下，相较于DBTD修饰的磷脂分子（DBTD-PL），展现出更高的光加速标记效率（18.3倍对比3.1倍，图3f-g）。这一特性使得DBTDD-PL特别适用于活细胞膜的多维协同光控生物正交偶联应用。此外，借助数字微镜技术实现双波长光刻刺激，作者成功实现了1.3微米分辨率的细胞膜节段示踪（图3h）。这充分证明了DBTDD在探索活体系统中光能利用方面的巨大潜力，具有极高的应用价值。

总体而言，七元硫杂环偶氮苯二氧化物作为一类合成简单且稳定的光开关分子，与悉尼酮协同组成双波长相交光控制的光点击系统，为三维高精度活细胞成像和生物材料原位光打印研究提供了新的化学基础。

图3. 在活HeLa细胞膜上进行双波长协同光点击生物正交修饰人工磷脂分子。

论文信息

Light-intersecting Photoclick Reactions for Bioorthogonal Labeling on Single Cells: Dibenzo[b,f][1,4,5]thiadiazepine-11,11-dioxide as a Photoswitchable Reporter

Zhihao Liu, Cefei Zhang, Sitong Li, Dr. Yuqiao Zhou, Fengying Lan, Prof. Dr. Xiaohu Zhao, Prof. Dr. Zhishan Su, Prof. Dr. Changwei Hu, Prof. Dr. Pengchi Deng, Prof. Dr. Zhipeng Yu

该论文的第一作者是四川大学化学学院的硕士研究生刘志豪和博士研究生张策飞，通讯作者是苏志珊教授、邓鹏翅教授和余志鹏教授。

Angewandte Chemie International Edition

DOI: 10.1002/anie.202501936