Angew. Chem. ：碱基切除修复酶引导的DNA自组装

各种原因导致的DNA损伤可能会引起DNA突变，进而导致基因组的不稳定，引发癌症等疾病。DNA修复酶作为一类重要的酶，能够通过各种机制识别并纠正这些DNA异常，起着维持基因组完整性的作用。其中，碱基切除修复（BER）途径是最重要的修复机制之一，涉及的30多种酶协同作用以维持DNA的完整性。在BER途径中，损伤的碱基被识别后，尿嘧啶DNA糖苷酶、氧代鸟嘌呤糖苷酶等DNA糖苷酶会将相应的损伤碱基移除。BER酶的重要性正日益凸显，这些酶可以作为生物标志物、以及很多疾病的潜在治疗靶点，还可以被用来控制新发展的生物技术系统，从而进一步应用于传感和药物递送。

近20年来，人们运用DNA纳米技术创造了很多由人工合成核酸组成的、可应用于传感和药物递送的生物分子器件。例如，人工合成的核酸可作为构建模块，组装成可编程的DNA纳米结构，这些结构又能被进一步以埃级精度修饰上各种化学和生物物质。利用DNA纳米结构的可编程性，可以使其在不同触发信号的作用下发生组装/解组装、或空间结构的改变，最终产生可测量的输出信号，或者释放出药物。目前报道的各种触发信号包括：DNA、小分子、抗体、pH、温度、光。DNA修复酶有着较高的多样性、以及与DNA的相关性，然而，还没有以这些酶为触发信号，来控制DNA纳米结构的组装的报道。

图1 碱基切除修复（BER）酶引导的DNA砖块自组装。

基于上述启发，意大利罗马大学Francesco Ricci课题组提出可以利用BER酶，以可预测的、正交的方式来控制DNA纳米结构的组装。为此，作者应用了一种由5条不同DNA链杂交而成的双交叉DNA砖块（DAE-E），砖块上4个5 nt的粘性末端使得砖块能够自发组装成微米级的空心管状聚合体（图1a；红色部分为粘性末端）。根据之前的报道，DAE-E的自组装能力可以被一条DNA链（称为侵入链或抑制链，能够封闭4个粘性末端之一）可逆地抑制，之后，自组装能力又可被另一条DNA链激活（称为抗侵入链或激活链，能够通过链取代反应使侵入链脱离砖块）。为了实现BER酶控制的DNA砖块自组装，作者设计了针对不同BER酶的、含有不同突变碱基的dsDNA组件（图1b）。dsDNA组件上的突变碱基在相应BER酶的作用下被移除，形成缺碱基位点或缺口后，dsDNA失去稳定性并释放激活链，接着DNA砖块被激活链激活，开始自发组装成管状结构。

图2 尿嘧啶DNA糖苷酶（UDG）引导的DNA砖块自组装。

首先，作者尝试用尿嘧啶DNA糖苷酶（UDG）来控制相应的组件（图2a）。UDG能够水解ssDNA或dsDNA上的脱氧尿嘧啶，进而导致缺碱基位点的形成。在该实验中，UDG响应性组件由1条激活链（绿色，标记了荧光）和1条含有4个脱氧尿嘧啶的互补链（黑色，修饰了猝灭剂）组成。在UDG的作用下，脱氧尿嘧啶位点变为缺碱基位点，dsDNA因此失去稳定性并释放激活链，该激活链再激活DNA砖块。荧光强度随时间的变化、以及非变性PAGE电泳的结果证明了UDG诱导的激活链释放，并且当UDG浓度在0.1-20 U/mL的范围内时，释放速率具有UDG浓度依赖性（图2a-b）。接着，为了在不涉及复杂自组装过程的情况下证明释放的激活链能够激活DNA砖块，作者采用了缺少粘性末端，因而无法自组装的对照砖块来进行实验（图2c）。当激活链存在时，砖块被激活，对照砖块上的荧光染料与侵入链上的猝灭剂分开，荧光信号增强。结果显示，随着UDG浓度由0.1 U/mL逐渐升高至20 U/mL，激活砖块所需的时间（t_{1/2_Act}，50%砖块被激活所需的时间）由230 ± 5 min缩短至1.9 ± 0.2 min（图2d）。然后，为了证明UDG能被用来控制DNA砖块的自组装，作者采用了含有粘性末端的砖块来进行实验（图2e）。作者在砖块内部标记了荧光染料Q670，以通过荧光显微镜跟踪自组装的情况。结果显示，在未加入UDG的条件下，孵育48 h时仍然观察不到组装体的形成，随着UDG浓度由0.01 U/mL逐渐升高至20 U/mL，孵育24 h时的组装体平均长度（<L>，μm）由0.6 ± 0.1 μm增加至2.1 ± 0.2 μm，结构总数（<C>，结构数量/mm²）的变化也呈现出类似的趋势（图2f、g）。

图3 甲酰胺嘧啶DNA糖苷酶（Fpg）引导的DNA砖块自组装。

为了进一步证明该方法的通用性，作者转向了甲酰胺嘧啶DNA糖苷酶（Fpg）。Fpg能够识别并切除8-氧-7，8-二氢鸟嘌呤（GOXO），最终使得DNA链上产生1核苷酸的缺口。如图3a所示，作者设计的Fpg响应性组件由2条链组成，其中1条链的内部含有1个GOXO，该碱基将随机序列（黑色部分）和激活序列（红色部分）分开。当Fpg存在时，响应性组件因为Fpg的作用而失去稳定性，并释放激活链。非变性PAGE电泳的结果证明，激活链的释放具有Fpg依赖性（图3b）。利用缺少粘性末端的对照砖块，作者证明了释放的激活链能够激活DNA砖块，且该过程具有Fpg浓度依赖性（图3c、d）。随着Fpg浓度由1 U/mL逐渐升高至100 U/mL，激活砖块所需的时间（t_{1/2_Act}）由40.0 ± 0.8 h缩短至1.0 ± 0.2 h。作者又在含有粘性末端的砖块内部标记了荧光染料Q570，以通过荧光显微镜跟踪自组装的情况（图3e）。结果显示，在未加入Fpg的条件下，孵育48 h时仍然观察不到组装体的形成，随着Fpg浓度由5 U/mL逐渐升高至100 U/mL，孵育24 h时的组装体平均长度（<L>，μm）由1.3 ± 0.2 μm增加至3.6 ± 0.3 μm，结构总数（<C>，结构数量/mm²）的变化也呈现出类似的趋势（图3f、g）。

图4 利用2种BER酶来控制砖块在组装体中的分布。

为了证明这2种响应性组件是正交的，能在同一体系中独立发挥作用而不受干扰，作者向同一溶液中加入了这2种响应性组件、以及相应的2种DNA砖块。其中，2种DNA砖块含有相同的粘性末端，因而能够发生共组装（图4a）。UDG和Fpg分别诱导不同的组件释放出激活链，特定的激活链再分别激活不同的砖块。通过荧光显微镜，可以容易地区分出被不同荧光团（Q670或Q570）标记的2种砖块。如图4b所示，通过改变2种酶的浓度，可以控制砖块在组装体中的分布。当只存在1种酶时，形成只由1种砖块组成的、绿色或红色的组装体；当2种酶的总体活性相当时，形成同时含有2种砖块的组装体。2种砖块在组装体中的分布依赖于它们被激活的速率，可以用激活砖块的摩尔比例（χG和χR）来方便地表示2种砖块在组装体中的分布。例如，当溶液中只存在绿色的激活砖块时（即χG = 1），形成了完全是绿色的组装体；当χG = χR = 0.5时，形成了绿色砖块和红色砖块含量相当的组装体。所以，作者根据之前观察到的、依赖UDG或Fpg浓度的组装速率（图2f、3f），建立了关于χG的动力学模型（图4c）。结果显示，在不同的酶浓度下，模型预测的χG均能与实验测得的χG很好地对应（R² = 0.99）。

图5 2种BER酶引导的DNA砖块可逆自组装/解组装。

之后，作者进一步尝试用这2种BER酶来控制DNA砖块的可逆自组装/解组装。作者采用了上述Fpg响应性组件（图3），并设计、表征了新的UDG响应性组件，该UDG响应性组件会在UDG的作用下释放侵入链，侵入链再结合砖块的4个粘性末端之一，引起组装体的分解（图5a）。实验结果显示，向含有2种响应性组件、以及未激活砖块的溶液中加入Fpg后，形成了管状结构，接着再加入UDG，形成的管状结构则完全分解（图5b）。

图6 用BER酶抑制剂来控制DNA砖块的激活。

基于以上结果，作者尝试在BER酶引导的DNA砖块自组装体系中加入BER酶抑制剂，从而用BER酶抑制剂来控制DNA砖块的激活。尿嘧啶糖苷酶抑制剂（UGI）是一种小蛋白，能与UDG形成稳定的UDG-UGI蛋白复合物，从而抑制UDG的活性。如图6a所示，随着UGI浓度的升高，组装体的平均长度（<L>，μm）逐渐缩短，当UGI浓度达到10 U/mL时，观察不到结构的形成。2-硫代黄嘌呤（2TX）是一种Fpg抑制剂，如图6b所示，随着2TX浓度的升高，组装体的平均长度（<L>，μm）逐渐缩短，当2TX浓度达到10 mM时，观察不到结构的形成。最后，作者尝试用2种BER酶抑制剂来控制同一体系中2种砖块的激活。在该实验中，所采用的2种砖块含有相同的粘性末端，但2种砖块能被不同的激活链选择性地激活（图6c）。当2种抑制剂均不存在时，2种砖块被激活后共组装成同时含有2种砖块的组装体；只存在1种抑制剂时，形成了完全是绿色或红色的组装体。此外，也可以通过改变抑制剂浓度来调节相应砖块在组装体中的分布。

总之，作者设计了2种具有BER酶响应性的dsDNA组件，组件中的脱氧尿嘧啶或8-氧-7，8-二氢鸟嘌呤被UDG或Fpg识别并切除后，dsDNA失去稳定性，释放出控制DNA砖块自组装的激活链或侵入链。该方法具有可编程性，并且2种响应性组件能在同一体系中独立发挥作用，选择性地作用于特定砖块。根据建立的动力学模型、以及2种酶的浓度，可以精确地预测出2种砖块在组装体中的分布。也可以用BER酶抑制剂来选择性地控制相应砖块的激活，进而控制砖块在组装体中的分布。

论文信息

DNA Tile Self-Assembly Guided by Base Excision Repair Enzymes

Nada Farag, Gianfranco Ercolani, Erica Del Grosso, Francesco Ricci

Angewandte Chemie International Edition

DOI: 10.1002/anie.202208367