开发能够精确快速检测非核酸生物标志物的高效分子诊断技术，对于疾病诊断和预测至关重要。得益于可编程性和高特异性的独特优势，CRISPR/Cas12a技术在超灵敏分析方法的开发中展现出巨大潜力，并在精准分子诊断中实现了变革性应用。由于CRISPR/Cas12a的反式切割活性无法被非核酸靶标直接激活，通过将非核酸靶标衍生的输入转化为”激活器”核酸序列（ssDNA或dsDNA）激活CRISPR/Cas12a的反式切割活性，从而无差别地切割单链DNA（ssDNA）报告分子即可实现非核酸靶标的检测。基于此设计原理，近年来CRISPR/Cas12a技术已被用于多种非核酸靶标的检测。尽管取得了系列进展，CRISPR/Cas12a技术在非核酸靶标检测中仍存在两个不可忽视的瓶颈：（1）非核酸靶标无法通过靶标预扩增策略进行扩增，导致检测灵敏度严重不足；（2）传统ssDNA报告子之间的随机碰撞导致切割反应动力学速率低，稳定性差以及荧光染料的光漂白等问题进一步导致检测灵敏度不足，因此，开发一种无需靶标预扩增，但同时具有增强的切割反应动力学、更高灵敏度和稳定性的非核酸靶标检测方法，仍然面临着巨大挑战。
针对上述科学问题，青岛科技大学罗细亮/徐升豪课题组基于前期CRISPR/Cas12a和等离子体激元共振增强荧光（PEF）的研究基础，（Nano Lett. 2025, 25, 1666–1672; Anal. Chem. 2025, 97, 8429-8435; Chem. Sci. 2024, 15, 566-572; Anal. Chem. 2024, 96, 16971–16977; Anal. Chem. 2024, 96, 4402-4409; Anal. Chem. 2023, 95, 3525-3531），开发了一种自催化环状DNA（cir-DNA）增强的等离子体CRISPR/Cas12a分子诊断平台，结合空间限域效应实现了非核酸靶标的超灵敏检测。如图1所示，作者设计了一个由非核酸靶标（以全氟辛酸，PFOA为例）的适配体序列与激活器序列杂交而构建的信号转导器。当非核酸靶标识别并结合其适配体序列时，单链激活器序列被释放从而激活Cas12a的反式切割活性，导致金纳米立方体（Au NCs）报告分子被切割并伴随荧光恢复。在此基础上，作者还设计并引入了cir-DNA结构，它包含两个功能域：Cas12a切割底物单链DNA区域和包含PAM序列的双链DNA激活区域。当Cas12a切割环状DNA的单链区域后，环状DNA线性化为双链DNA激活器，可重新激活新的Cas12a分子，形成自催化循环。该技术通过创新性地整合正反馈放大机制与空间限域效应，攻克了非核酸生物标志物检测灵敏度低的瓶颈，为分子诊断领域带来了突破性进展。
图1. 基于正反馈自催化环状DNA的等离子体CRISPR/Cas12a分子诊断平台用于非核酸靶标检测示意图。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.
针对荧光染料光漂白导致的灵敏度不足问题以及CRISPR/Cas 12a与传统ssDNA报告子之间随机碰撞导致的切割反应动力学速率低，稳定性差等问题，作者合成了金纳米立方体（Au NCs）并选择其作为空间限制效应和PEF基底，制备了Au NCs报告子（图2）。与传统ssDNA报告子相比，Au NCs报告子具有更快的反应动力学，反应时间缩短至15 min，荧光强度提高了近7.8倍。此外，由于球形核酸设计，Au NCs报告子对核酸酶（如DNase I）以及FBS的抗降解能力也得到了提升（图3）。
图2. 金纳米立方体的透射电镜、扫描电镜等表征以及金纳米立方体报告子的红外光谱、Zata电位、吸收光谱及DLS表征。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.
图3. 金纳米立方体报告子与传统ssDNA报告子的反应动力学及稳定性对比。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.
在以环境污染物全氟辛酸（PFOA）为模型的检测中，该分子诊断平台对PFOA的检测灵敏度较传统方法提升了52倍。同时，如图4所示，作者还引入卷积神经网络（CNN）模型，通过对荧光图像空间特征的提取，实现了对阈值附近样本的精准区分。CNN模型将盲测样本分类准确率AUC值从79.1%提升至97.7%。该技术不仅为环境污染物监测提供了新方案，更在妊娠风险评估、疾病早期诊断等领域展现巨大应用潜力。
图4. 基于CNN的PFOA检测风险分层工作流程及性能分析。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.
该研究成果近期发表在Angewandte Chemie International Edition 上，文章的第一作者是2023级硕士研究生姚旺，通讯作者是青岛科技大学徐升豪副教授和罗细亮教授。该研究得到国家自然科学基金（21505081、22374085)）、山东省自然科学基金面上项目（ZR2023MB110）的资助支持。
原文：
Autocatalytic Circular DNA Powered Plasmonic CRISPR/Cas12a Platform for Ultrasensitive Non-Nucleic Acid Target Sensing
Wang Yao, Xiaohan Xu, Xingguo Zhai, Tong Ji, Ruyi Zhang, Shenghao Xu, and Xiliang Luo
Angew. Chem. Int. Ed. 2025, DOI: 10.1002/anie.202516838
导师介绍
罗细亮
