Angew. Chem. ：通过释放产物来加速DNA聚合

强大的Watson-Crick碱基互补配对是利用DNA构建纳米结构和反应网络、检测致病RNA等应用的基础。然而，多步反应或级联反应的一个致命弱点，是双链配对的结合能对寡核苷酸链长度的强烈依赖性。在级联反应中，单个序列可以发挥不同的功能，参与多个反应步骤（如图1a）。而这些步骤可能需要相互冲突的结合和解离率。例如，长序列可以通过稳定复合物的结构，加速复合物的形成，但会减慢网络中其他反应的速率，从而限制整体的速率。因此，许多DNA反应网络都在数小时的时间尺度上运行。为了解决多步反应的复合速率存在上限的问题，约翰霍普金斯大学的Rebecca Schulman教授课题组尝试使用DNA解旋酶（一类依赖ATP并将双链DNA分离成单链的蛋白）来解除涉及相同序列的不同DNA杂交反应之间的相互干扰，从而减少反应速率对结合强度的依赖性。

图1. PER反应的过程及Sabatier原理图示。

作为示例，作者尝试利用解旋酶驱动的解旋过程来提高引物交换反应(primer exchange reaction, PER)的速率。PER可将具有指定序列的新结构域附加到单链输入链（引物）上（图1a），从而识别输入链并放大信号。PER包括四步（图1a），首先，具有3’悬垂链的发夹可逆地与引物结合（平衡结合）。然后DNA聚合酶以发夹为模板，延伸引物并取代发夹顶部链（DNA聚合）。被置换的发夹顶部链与新生链可逆地竞争与发夹上的模板结构域的结合（链置换）。最后，产物从发夹中可逆地释放（平衡释放）。已知引物长度在10-12个核苷酸的PER在37°C下的延伸只需几分钟，但更长或更短的引物的延伸则要慢得多，这符合Sabatier原理，即只有当底物-催化剂结合不太弱，同时产物-催化剂结合又不会强到毒化催化剂时，反应才会进行（图1b）。

在本文中，作者通过将带有强结合能的引物、速率较慢的PER反应，与依赖ATP的解旋酶Rep-X催化的DNA解旋反应偶联，实现对PER反应的加速。作者首先建立了一个模型，来预测PER速率对反应温度和引物长度的依赖性，从而解释了PER仅在很窄的引物长度范围内才能够快速发生的原因。随后，作者使用此模型，预测了解旋酶活性对PER速率的影响。最后，作者在解旋酶存在的情况下，测量了PER速率，证明了解旋酶可以用作DNA纳米技术中的可预测的反应加速工具。

图2. PER反应过程以及结合域长度、温度对PER速率的影响。

作者开发了一个简单的分析模型，来分析PER速率对反应物/产物和催化剂链之间的结合能的依赖情况。其中引物（反应物，R）在平衡结合步骤中与发夹（催化剂，C）结合，正向和反向（或开和关）速率常数分别为k_1f和k_1r。另外，作者将DNA聚合和链置换步骤建模为有效速率常数为k₂的不可逆反应。最后，产物在平衡释放过程中从发夹中释放出来，正向和反向速率常数分别为k_3f和k_3r（图2a）。

当PER处于稳态，并且反应物比催化剂多得多时，作者假设只有反应物浓度[R]和产物浓度[P]随时间变化，而未被占用的催化剂[C]、催化剂-反应物复合物[RC]和催化剂-产物复合物[PC]浓度保持不变。另外，作者假设反应物与产物对催化剂发夹的结合强度相同，则k_1f＝k_3f＝k_f，k_1r＝k_3r＝k_r，平衡常数K= k_f / k_r。基于以上假设以及Michaelis-Menten动力学，作者建立了用于计算反应速率与反应半衰期的方程模型：

根据模型，作者预测，在25°C时，使用长度为10个核苷酸的引物，反应速率最大；在37°C时，使用长度为12个核苷酸的引物的反应速率最大；更短或更长的引物会导致反应较慢。

作者接下来测量了反应速率随反应物和催化剂之间的结合能变化的曲线，来验证模型是否正确。作者通过改变温度，和改变催化剂发夹上的结合域的长度来调节这种结合能。同时，作者设计了一种报告方案（图2b），通过检测报告分子的荧光强度，来检测不同时间点的产物浓度变化（图2c）。根据图2c，作者将产物形成的初始速率除以C0和R0则得到转换频率kcat，用于对比具有不同催化剂浓度的PER反应的速率。基于上述数据，图2d显示了在25°C和37°C下实际测量的反应速率随结合域长度变化的函数。在25°C时，作者通过实验观察到，反应速率在结合域长度为10个核苷酸左右时达到峰值，而在37°C时，反应速率在12个核苷酸左右达到峰值，实际测量与模型预测结果相符。

根据模型与实验结果，引物的结合时间既应该足够短以使产物及时解离，但又应足以使聚合酶结合并发挥聚合活性。而该结合时间取决于杂交能量，这意味着仅当引物的杂交能量在非常窄的范围内时，PER才能有效进行。因此，作者接下来尝试利用依赖于ATP的解旋酶来分离DNA双链，从而摆脱杂交能量对PER反应中的引物序列和长度的限制。

图3. 基于模型预测解旋酶对产物-催化剂复合物的解离、底物-催化剂复合物的解离、以及对PER整体速率的影响。

作者选择了工程化的解旋酶Rep-X，它选择性地靶向具有单链3’悬垂端的复合物，因此理论上只会从复合物中去除产物，而不会影响反应物的结合。为了量化Rep-X对PER速率的影响，作者引入了新的参数k_h，表示Rep-X解开产物-催化剂复合物的速率。同时，引入k_l表示由解旋酶引起的、反应物从催化剂上非预期解离（泄漏）的速率，k_l＝L×k_h, L是泄漏参数，即Rep-X解开无3’悬垂端的复合物与解开有3’悬垂端的复合物的相对速率（0＜L＜1）。因此，加入解旋酶后反应速率的模型为：

作者在图3c中展示了在不同解旋酶速率下，基于上述模型预测的转换频率kcat与结合域长度的函数，表明反应速率仅在引物与催化剂处于强结合状态下，才会受解旋酶的影响。另外，图3d显示了由解旋酶引起的泄漏反应对PER速率的影响，表明具有更高的选择性的解旋酶会导致更大的速率增幅。总之，作者通过模型证明，加入解旋酶可以明显降低结合域长度对PER速率的限制，即使所选解旋酶不能仅特异性地解离产物-催化剂复合物。

图4. 实验测得的不同浓度的解旋酶Rep-X对目标复合物的解离速率及泄漏速率。

为了评估解旋酶Rep-X对PER反应速率的影响，作者利用图4a中的两个报告复合物测量了k_h和k_l。这两个报告复合物序列相同，但其中一个复合物R₁:R₁具有3’悬垂端，而另一个复合物R₂:R₂’具有5’悬垂端。R₁:R₁’复合物发生杂交时，因为接近猝灭基团，荧光被猝灭，因此荧光信号就可以反映被解旋的、处于非杂交状态的R₁的浓度，作者可以据此计算k_h（图4b）。作者发现，在加入Rep-X和ATP后，最初，绝大多数的报告复合物处于非杂交状态，Rep-X活性很高。随着反应的进行，[R₁]降低，表明由于ATP的消耗，Rep-X的解旋速率随时间降低。接下来，作者通过将具有3’悬垂端的复合物的未结合报告链的数量，与具有5’悬垂端的复合物的相比，来计算不具有3’悬垂端的复合物的相对解旋速率，从而评估Rep-X的泄漏情况（图4c）。作者发现，泄漏情况的反应速率似乎仅微弱地取决于Rep-X的浓度。

基于上述对Rep-X的解旋性能的测量，作者认为，在10-30 min内，100 nM Rep-X的解旋速率在10^-1 s^-1到10^-3 s^-1之间，而泄漏速率仅为10%，因此只会微弱地降低解旋酶对PER反应的加速效果（图3d）。总之，作者认为，在弱结合情况（结合域长度小于10 nt）时，解旋酶几乎不会影响PER反应的速率；但在强结合情况（10-20 nt）时，解旋酶至少可以使反应加快一个数量级。

图5. Rep-X的添加对PER反应的加速效果。

基于上述预测，作者接下来测试了Rep-X对PER反应的加速效果。作者首先测量了结合域长度为16 nt的PER反应的速率（图5a），发现加入100 nM Rep-X和1 mM ATP使反应加速了30倍。作者随后测量了结合域长度为6-18 nt的PER反应速率，并与模型计算的转换频率k_cat与结合域长度的关系进行了拟合（图5b），证明了由Rep-X辅助的产物的解离可以加快强结合情况下的PER速率。

总之，作者在本研究中，通过理论模型和实验测量，表明可以通过添加解旋酶Rep-X，来加快引物（反应物）与发夹模板域（催化剂）处于强结合状态时的PER反应的速率。

论文信息

Catalytic DNA Polymerization Can Be Expedited by Active Product Release**

Pepijn G. Moerman, Momcilo Gavrilov, Taekjip Ha, Rebecca Schulman

Angewandte Chemie International Edition

DOI: 10.1002/anie.202114581