本次跟大家分享一篇发表在Angewandte Chemie International Edition上的文章。文章的题目是Light-ControlledTyrosine Nitration of Proteins。该文的通讯作者分别是中国药科大学生命与技术学院的田浤老师和南京大学化学化工学院的王欢教授。田浤老师的主要研究方向为蛋白质化学修饰、遗传密码扩充技术及其应用。王欢教授的主要研究方向是大环的合成、蛋白质化学修饰以及非编码RNA功能的开发。
含有生物活性的硝基芳香烃天然产物广泛分布于植物、真菌、细菌和哺乳动物等所有生命领域。除了小分子代谢物外，细胞生物分子的硝化主要包括寡核苷酸、脂质和蛋白质等的硝基化。酪氨酸（Tyr）硝化是许多生物体中最重要的氧化蛋白翻译后修饰（PTMs）之一，与人类的生理、病理和衰老密切相关。在生命体内，酪氨酸残基被一氧化氮衍生的氧化剂转化为3-NT残基，而3-NT在细胞蛋白中的积累通常被认为是炎症相关条件和包括癌症和神经系统疾病在内的各种疾病的生物标志物。硝化作用极大地改变了酪氨酸的物理化学性质，包括酚基的pKa值、疏水性、氧化还原电位和空间体积，从而影响蛋白质的结构和功能。
尽管酪氨酸硝化在蛋白质中的生物学意义重大，但由于缺乏将3-NT残基整合到蛋白质中的方便方法，相关研究一直受阻。基因编码扩展平台提供了一个强大的工具，在体内产生具有特定位置的3-NT蛋白。然而，这些方法的蛋白质产量通常很低，特别是当需要多个3-NT掺入时。蛋白质的化学硝化是一种重要的替代方法。目前用于蛋白质硝化的试剂包括过氧亚硝酸盐/CO2、H2O2/亚硝酸钠/过氧化物酶、林西多明（SIN-1）、四硝基甲烷（TNM）和NaNO2。然而，这些化学方法通常需要过量的硝化试剂，延长反应时间（通常为数小时），以及低到中等的改性收率。更重要的是，这些蛋白质硝化试剂通常缺乏对酪氨酸的化学选择性，导致多种副反应的发生，如酪氨酸的羟化、半胱氨酸/蛋氨酸/色氨酸残基的氧化和通过3,3 ' -二酪氨酸交联的蛋白质寡聚等。
作者根据之前的研究基础确定DNIm为酪氨酸硝基化的硝基供体。通过对DNIm的光响应特性的探究，发现它对生物亲核试剂如赖氨酸是稳定的。DNIm的吸收光谱可达400 nm，因此作者选择390nm LED作为光源。首先作者用对甲苯酚（图2A，1a）和酪氨酸类似物（图1A，1b）分别作为研究对象通过和DNIm在光的调控下形成对应的硝基化产物，并得到不错的产率（分别为70%和72%），并提出两种反应机理（图2B）。同时作者还以多种芳基酚为母体进行了相关的硝化实验，其中苯酚类的化合物都得到不错的产率，萘酚类的化合物的产率有所下降。紧接着作者又在多肽水平上对该硝化反应进行探究。在水相条件下，DNIm能有效地完成肽的酪氨酸硝化。三肽P-1在pH 6.0的PBS缓冲液中被DNIm在光照下硝化，转化率大于95%（图3A）。同时DNIm对肽的硝化对酪氨酸残基具有化学选择性，含有Phe、His和Met的三肽P-2-P4都没有被DNIm修饰（图3B）。多肽P6-P8，以及内啡肽和亮啡肽，都在酪氨酸残基上被特异性硝化，证明了能够通过该反应合成含3-NT的生物活性肽（图3B）。作者进一步探究了DNIm修饰复杂的含酪氨酸的天然产物套索肽并取得了非常好的效果（3C和3D），同时并且证明酪氨酸硝基化的caulonodin IV的热稳定都有所提高（3E）。
图3 DNIm介导的含酪氨酸肽的硝化作用。
为了检测DNIm导入3-NT蛋白的能力，作者选择了含有三个Tyr残基的溶菌酶作为模型蛋白进行探究。溶菌酶与14倍的DNIm在pH 6.0的PB缓冲液中孵育，在390 nm的照射下，在10分钟内产生了单一酪氨酸硝化的溶菌酶为主要产物（图4）。酶切消化利用质谱鉴定到是23位的酪氨酸被硝基化了。同时DNIm也对RNase A和histone-H2A的酪氨酸硝化也具有较高的特异性。这些数据表明，无论是在天然条件下还是变性条件下，DNIm都是一种高效和高化学选择性的酪氨酸硝化试剂。
图4 DNIm光触发酪氨酸对蛋白质的硝化作用。
DNIm对酪氨酸硝化的高化学选择性和快速反应速率促使作者探索了其在研究氧化PTM对蛋白质生物物理性质的影响方面的应用。a-Synuclein (ASN)因其酪氨酸硝化与神经退行性疾病(包括帕金森病)有关而备受关注。与NaNO2和过氧亚硝酸盐溶液相比，DNIm在ASN蛋白中表现出更强的硝化能力。LC-MS/ MS分析显示，DNIm在10分钟内将ASN蛋白绝大部分转化为(3-NT)4-ASN（图4）。然而，通过体外搅动，(3-NT)4-ASN完全失去了聚集的趋势，并且在野生型ASN样本中加入(3-NT)4-ASN会以剂量依赖的方式导致延迟聚集。ASN蛋白在体内的聚集是一个高度复杂的过程，这些蛋白的酪氨酸硝化进一步使其复杂化。作者设计了一种实验，首先在体外搅动野生型ASN一段时间，使富β-sheet-rich ASN低聚体、原纤维或原纤维逐渐形成（图5A）。在选定的时间点（0、1、2和第5天），在390 nm照射下用2.0或10.0 当量的 DNIm处理ASN蛋白10 min，分别产生部分或全部酪氨酸硝化。然后对产生的ASN样本进行进一步搅拌，并通过ThT荧光法每24小时检测一次聚集情况，直到第8天。结果表明，不经DNIm处理，ASN在5 d内聚集达到最大水平(图5B和C)。当样品在搅拌早期（第0天和第1天）用DNIm处理时，经过硝化的ASN蛋白完全失去了通过搅拌组装成富含b片的低聚体的趋势（图5B、C）。在第2天，当大量β-sheet-rich ASN低聚体积累时，酪氨酸硝化使ThT荧光强度在DNIm处理后立即降低了26 42%，并抑制了进一步搅动引起的ThT荧光的增加（图5B、C）。这些结果表明，ASN硝化在这一阶段诱导了ASN低聚体的部分解离，阻止了ASN进一步组装的进程。综合所有数据表明，酪氨酸硝化抑制ASN单体形成β-sheet-rich的聚集体或被吸收到现有聚集体的能力。ASN的硝化作用对已经稳定形成的β-sheet-rich的团聚体影响有限。因此，与传统的蛋白质硝化方法相比，该酪氨酸硝化方法提供了一个显著改进的平台，以时间分辨率模拟和研究氧化PTM如何影响蛋白质的生物物理行为。
图5 体外搅拌过程中酪氨酸硝化对ASN聚集的影响。
最后，作者用这种方法制备了具有治疗潜力的(3-NT)蛋白。通过实验，作者的研究提供了第一个证据，证明mTNFa的免疫原性高度依赖于3-NT残基的数量，并证明3-NT残基数量的增加不一定会导致更强的免疫原性。
总结，作者开发了一种简单而有效的二硝基咪唑试剂，用于光控肽和蛋白质中的酪氨酸硝化。该硝化方法对酪氨酸残基的化学选择性高，反应动力学快，优于传统的蛋白质硝化试剂。通过对各种苯酚衍生物、复杂肽和蛋白质的酪氨酸硝化，证明了试剂的适用性。除了为酪氨酸硝化提供一种新的工具外，该的光控方法可能为研究酪氨酸硝化对蛋白质生物物理和免疫特性的影响提供一种通用策略。本研究中描述的光控化学策略为开发一类新的化学工具来研究蛋白质酪氨酸硝化的作用铺平了道路，并可能提供光操纵蛋白质硝化的机会。
