今天给大家分享一篇在Biomacromolecules上发表的文章，题为：Polymer Modification of Lipases, Substrate Interactions, and Potential Inhibition。该工作的通讯作者是来自迈阿密大学的Dominik Konkolewicz和 Richard C. Page教授。

为了满足不断增长的能源需求，生物柴油（脂肪酸甲酯）越来越得到了大家的青睐。生物柴油可以通过酸、碱和酶催化的酯交换反应获得，其中使用脂肪酶进行催化的条件温和，具有很大的优势。但是酶的工业应用通常受到一些因素的限制，例如对环境的耐受性和长期稳定性。因此，对脂肪酶研究的主要目标是在极端条件下提高酶的活性和稳定性，这可以通过将聚合物连接到酶上来实现。

1977年，科学家首次报道了将聚乙二醇与蛋白质进行偶联的方法，随后就逐渐利用聚合物的特性来产生功能性和刺激性响应的“智能偶联物”。此外，将蛋白质与聚合物偶联会提高它们在有机溶剂中的活性和稳定性，以及它们的热稳定性。其中Jiang和Keefe对两性离子聚合物的研究显示，它们在使蛋白质保持一定程度的生物活性的同时，还可以提高蛋白的稳定性，因此具有光明的前景。

在本文的研究中，作者选用了南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)，它在水和有机介质中都能起作用，且具有广泛的底物特异性。脂肪酶的最新研究包括通过固定在不同载体上来提高活性和稳定性，以及接枝疏水性或两性离子聚合物。在本文中，作者通过Grafting-to的方式将亲水性和疏水性聚合物与CalB进行偶联，并探究偶联物对有机溶剂和温度的耐受性，随后进行比较分析。

图1.  (A)RAFT聚合；(B)Grafting-to偶联反应；(C)本文中用到的聚合物的单体。

如图1，作者首先通过RAFT聚合制备了一系列不同聚合度的聚合物。包括聚合度为10、25和50的pAM、pDMAm、pAMPSA和pDMAPA，来比较氢键以及离子基团对偶联物性能的影响。随后以嵌段共聚物的形式合成了pAm-b-NiPAm以及pAm-b-NiPAm-NIBMA，来比较疏水性基团对偶联物的影响。此外，为了探究AMPSA与CalB的结合特性，作者还制备了混聚物pDMAm-r-AMPSA。通过核磁和尺寸排阻色谱可以对聚合物进行表征。

作者以Grafting-to的方法得到了相应的CalB偶联物，通过基于离心的过滤来纯化偶联物，最终以UV-vis光谱、凝胶电泳来表征偶联的聚合物数目。作者首先在不同的溶剂中探究了CalB的二级结构变化，结果发现随着有机溶剂增加，野生型CalB的二级结构逐渐减弱，而偶联物的二级结构强度非常稳定。

图2.野生型及不同CalB偶联物在不同溶剂中的酶活结果。

如图2，作者将不同CalB偶联物与野生型CalB的活性进行了比较。结果显示，用亲水性中性聚合物pAm和pDMAm修饰的CalB的活性显著增强，且聚合物分子量越高，偶联物的活性越强，作者认为聚合物与底物可能发生非共价相互作用。相反，疏水性嵌段共聚物pAm-b-NiPAm和pAm-b-NiPAm-NIBMA修饰的CalB的活性反而下降，作者认为疏水性基团可能阻塞了酶的催化位点，并得到了实验验证。而阴离子偶联物的活性几乎丧失，这可能是因为阴离子聚合物会导致CalB三维结构的展开。

此外，作者发现对于较高浓度的乙醇体系，pAm偶联物的催化活性增强略低于pDMAm偶联物，这可能是溶解性的差异造成的。值得一提的是，阳离子pDMAPA的偶联物的活性随着乙醇和乙腈浓度增加而增强，且比野生型CalB的酶活性高2-3倍。

图3. 野生型及不同CalB偶联物在50或60 ℃的酶活结果。

作者通过将CalB及其偶联物在50或60 ℃下孵育0至6 h，不同时间间隔内检测其热稳定性。如图3，与天然CalB相比，孵育6小时后发现带有pAm和pDMAm的CalB偶联物依然保留了活性，证明提高了热稳定性。

总而言之，作者通过Grafting-to的方式得到了不同的CalB高分子偶联物，亲水性中性聚合物提高了CalB的有机耐受能力以及热稳定性；阳离子聚合物也显著提高了酶对有机溶剂的耐受性；而疏水性聚合物却使其失去了活性。综上所述，该方法为CalB酶在不同条件下的使用提供了新的潜力。

作者：LJH  审校：SJL

DOI: 10.1021/acs.biomac.0c01159

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.biomac.0c01159