分享一篇最近发表在Biomacromolecules上的文章，题目为Phosphorylcholine Polymer Conjugation Improves the Pharmaceutical Performance of Protein Therapeutics。本文的通讯作者是堪萨斯大学的Ming Zhao。
蛋白质疗法在治疗多种疾病方面潜力巨大，但其临床应用常受限于免疫原性强、体内半衰期短等问题。传统的聚乙二醇（PEG）化修饰虽能改善这些性能，但日益凸显的抗PEG抗体问题导致药物被加速清除，限制了其长期应用。因此，开发新型“隐形”聚合物替代PEG迫在眉睫。本研究聚焦于一种两性离子聚合物——聚（2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱）（PMPC），其具有优异的抗蛋白吸附特性且不易引发免疫反应。本文开发了一种基于硫醇-马来酰亚胺“点击化学”的高效、可控的PMPC-蛋白质偶联方法，并系统性地探究了PMPC聚合物链长对尿酸氧化酶（UOX）模型药物的理化性质、药代动力学、免疫原性及治疗效果的影响。研究结果表明，更长的PMPC链能带来更优越的全面性能，为蛋白质药物的精准优化提供了新平台和深刻见解。
作者首先通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合制备了三种不同聚合度（DP为30， 60， 90）的PMPC聚合物。随后，通过端基修饰，将聚合物末端的羧基转化为可与蛋白质上巯基反应的马来酰亚胺基团（PMPC-SMCC）。同时，利用Traut’s试剂将尿酸氧化酶（UOX）表面的氨基转化为巯基（UOX-SH）。最后，通过硫醇-马来酰亚胺点击反应，成功合成了三种不同链长的PMPC-UOX偶联物（PMPC30-UOX， PMPC60-UOX， PMPC90-UOX）（图1）。
图1. PMPC-UOX合成路线
SDS-PAGE电泳图显示，与天然UOX的单一条带相比，三种偶联物在非还原和还原条件下均呈现弥散的高分子量条带，证明PMPC成功共价连接在UOX上，且未形成分子间二硫键交联。动态光散射（DLS）结果表明，随着PMPC链长的增加，偶联物的流体动力学直径从天然UOX的8 nm依次增大至12 nm、19 nm和28 nm，直观证明了聚合物“外壳”的成功构建与增厚。琼脂糖凝胶电泳和Zeta电位分析共同表明，带负电的天然UOX在经过电中性的PMPC修饰后，其电泳迁移率显著降低，表面电位趋于中性。这证实了PMPC有效屏蔽了蛋白质的表面电荷，这是其实现“隐形”功能的基础（图2）。
图2. PMPC-UOX分子量及结构表征
作者评估了修饰对UOX酶学性能的影响。所有PMPC-UOX偶联物均保留了近乎100%的酶活性，且其米氏常数（Km）与天然UOX无显著差异，说明PMPC修饰在掩盖蛋白质表面的同时，并未阻碍底物进入活性中心；在稳定性方面，PMPC修饰显著提升了UOX的长期储存稳定性和抗冻融能力。作者将其归因于PMPC超亲水外壳防止了蛋白质的聚集，并可能像冷冻保护剂一样通过水合层抑制冰晶的形成（图3）。
图3. 修饰对UOX酶学性能的影响
作者进一步验证了PMPC的关键“隐形”特性与生物相容性。巨噬细胞吞噬实验显示，天然UOX被细胞大量摄取（绿色荧光强），而随着PMPC链长的增加，细胞内的荧光信号急剧减弱，PMPC90-UOX几乎不被吞噬，证明长链PMPC能有效逃避免疫系统的识别。蛋白吸附实验进一步证实，PMPC修饰能显著降低血清蛋白的吸附，且效果呈链长依赖性，PMPC90-UOX的抗吸附能力与PBS对照组相当，展现了优异的抗污能力。细胞毒性实验表明，所有偶联物在测试浓度下均无显著细胞毒性，具备良好的生物相容性，为体内应用奠定了基础（图4）。
图4. 天然UOX与PMPC-UOX偶联物的抗污性能及生物相容性研究
药代动力学研究显示，天然UOX在体内被迅速清除（半衰期t1/2=2.2 h），而PMPC修饰能显著延长其半衰期，且效果与链长正相关。PMPC90-UOX的半衰期长达20.2 h，是天然酶的9倍多。治疗效果上，单次注射PMPC90-UOX能持久地将小鼠血清尿酸水平从171 μmol/mL降至77 μmol/mL，并维持低水平至120小时；而天然UOX仅能短暂起效，48小时后尿酸水平即快速反弹（图5）。
图5. PMPC-UOX偶联物的药代动力学及药效学评价
在多次注射后，天然UOX引发了强烈的免疫反应，相比之下，PMPC90-UOX将抗体滴度显著降低了8倍，成功抑制了次级免疫激活。这表明PMPC外壳不仅能物理屏蔽蛋白质抗原表位，还能有效降低药物的免疫原性。
图6. 天然UOX与PMPC-UOX偶联物的体内抗体滴度
综上所述，本研究成功开发了一种高效、可控的PMPC-蛋白质偶联平台，更长的PMPC链能形成更厚、更致密的水合外壳，从而带来更优异的综合性能：包括完全保留的酶活性、增强的稳定性、卓越的“隐形”能力（抗蛋白吸附和免疫逃逸）、显著延长的体内循环时间、大幅降低的免疫原性，从而提升治疗效果。
作者：SYM 审校：ZHR
DOI: 10.1021/acs.biomac.5c00253
Link: https://doi.org/10.1021/acs.biomac.5c00253
