Cell Rep.｜氧水平影响脱氧羟腐胺赖氨酸羟基化从而调节蛋白N-末端翻译

为大家推荐一篇发表在Cell Reports上的论文，题目为“Oxygen level regulates N-terminal translation elongation of selected proteins through deoxyhypusine hydroxylation”，通讯作者是来自美国康奈尔大学的Hening Lin教授，Hening Lin教授课题组致力于PTM功能和调控等方面的研究，并针对调控过程开发小分子抑制剂，作为治疗人类疾病的潜在疗法。

真核翻译起始因子 5A (eIF5A)是细胞生长和存活所必需的蛋白质，羟腐胺赖氨酸修饰对eIF5A的功能至关重要，该修饰在体内通过两步完成：亚精胺通过NAD依赖的脱氧羟腐胺赖氨酸合成酶添加到赖氨酸侧链上形成脱氧羟腐胺赖氨酸（deoxyhypusine）；deoxyhypusine被羟化酶（Lia1）羟化形成最终的羟腐胺赖氨酸（hypusine）的翻译后修饰。目前的研究发现，这类羟化酶的缺失在高等真核模式生物中是致命的，因此，该修饰的羟基化步骤可能具有重要的生理功能。

首先，作者发现deoxyhypusine的羟基化受到氧水平的调节，随着氧气的逐步限制，hypusine 水平逐渐下降，而 deoxyhypusine 水平增加。接下来作者发现deoxyhypusine的羟基化酶Lia1敲除的菌株在不可发酵的碳源表现出生长缺陷，表明氧气调节的羟基化过程也与呼吸过程密切相关。因此作者猜测eIF5A羟腐胺赖氨酸修饰影响了此呼吸途径中的某些蛋白的表达。然后作者发现酵母中的乙醇脱氢酶2 (Adh2)在△Lia1菌株中显著下调，然而mRNA水平却没有变化，说明△Lia1菌株中Adh2的下调是由于翻译过程异常而减少。

脯氨酸是肽键形成的不良底物，有文献报道Hypusine修饰可以促进富含脯氨酸基序的翻译。然而，Adh2包含富含脯氨酸的“25-PVPKPKP-31”序列，因此作者猜测羟化酶Lia1的缺失可能抑制了这段序列的翻译。为了验证这一假设，作者用带有flag标签的荧光素酶替换了I24或P31之后的Adh2编码序列，令人惊讶的是，两种融合体的表达水平在△Lia1菌株中均比在WT菌株中低得多，这个结果推翻了他们上述的假设。因此，作者将萤光素酶融合到Adh2更靠前的编码序列，构建了一系列不同的截短形式，结果发现Lia1的缺失影响的是Adh 2的前9个氨基酸的翻译。这些结果表明，deoxyhypusine羟基化的缺乏影响Adh2的N末端翻译，而不是影响含脯氨酸的序列。

为了全面了解deoxyhypusine羟基化调节的蛋白质，作者还进行了SILAC蛋白质组学分析，以比较WT和△Lia1酵母菌株中的蛋白质水平，基于该方法，作者鉴定到了510种潜在的deoxyhypusine羟基化调节的蛋白质。为了对这些鉴定到的蛋白进一步验证，作者构建了双向启动子翻译报告系统，把mCherry放在双向启动子的一边，EGFP放在另一边，在EGFP的N末端插入感兴趣的蛋白质的N末端序列，N-末端序列的翻译效率由EGFP-mCherry荧光强度比表示，然后将△Lia1菌株中的荧光比率与WT菌株中的荧光比率再做比值分析，小于1.0的比率表明deoxyhypusine羟基化的缺乏抑制了该蛋白N-末端序列的翻译。

根据上述的研究结果，作者提出假设：一些与肽出口通道相互作用较弱的N末端序列可能无法正确延伸通过出口通道，导致肽转移酶中心(PTC)构象不正确，抑制肽键形成。在hypusine修饰的eIF5A帮助下，使新生肽延伸到肽出口通道中，并促进PTC中的正确构象，从而促进肽键形成。已知肽出口隧道狭窄且带负电荷，具有小且带正电荷的残基的肽序列受到肽出口通道的青睐，因此作者为了验证这一假设，作者将与肽出口通道具有良好相互作用的N-末端序列做了一系列突变，当突变成大的疏水残基或者负电荷残基，就会干扰肽与肽出口通道相互作用后，deoxyhypusine羟基化的缺乏就会导致了显著的翻译抑制。

总之，这项工作揭示了氧气调节的羟腐胺赖氨酸在eIF5A上的翻译后修饰对于蛋白N端翻译具有重要的调节功能。

本文作者：ZJ

责任编辑：MYZ

文章链接：

https://www.cell.com/action/showPdf?pii=S2211-1247%2822%2900628-3

原文引用：DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.110855